李傳貴， 王 強(qiáng)

(河北省保定市第一中心醫(yī)院泌尿外一科， 河北 保定 071000)

前列腺癌(prostate cancer)是西方男性最常見的腫瘤疾病，每年發(fā)病超16萬，死亡約2.7萬，是北美和歐洲男性癌癥死亡的第三大原因[1]。前列腺癌的高發(fā)區(qū)主要在西方發(fā)達(dá)國家，但是近年中國男性前列腺癌的發(fā)病率有逐年上升的趨勢[2]。Notch信號通路是一條介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間相互作用的高度保守的信號通路，其由Notch受體、配體以及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子組成，廣泛存在于各種生物中。研究表明，在非小細(xì)胞肺癌中， Notch配體DLL4可促進(jìn)腫瘤血管的發(fā)育和成熟，改善其結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)腫瘤的生長[3]；研究發(fā)現(xiàn)65%以上的T細(xì)胞極性淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)患者的Notch1基因呈高表達(dá)，可直接激活MYC的表達(dá)，Notch1和MYC調(diào)節(jié)前饋環(huán)路中的常見轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，促進(jìn)T-ALL腫瘤細(xì)胞的增殖和自我更新，提示Notch信號通路的激活可促進(jìn)某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。但是Notch信號在前列腺癌中的作用機(jī)制以及下游分子機(jī)制仍然有待于進(jìn)一步闡明，本文通過研究阻斷和激活Notch信號通路對前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移的影響和作用機(jī)制，為前列腺癌的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株和主要試劑:前列腺癌PC-3細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫，DAPT購自Sigma公司，過表達(dá)Notch1胞內(nèi)段病毒AdNICD腺病毒和對照AdCtrl病毒購自漢恒生物，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibico公司，胰蛋白酶、RIPA裂解液購自碧云天公司，Trizol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自Takara公司，EdU試劑盒購自廣東銳博公司，Matrigel (1∶8稀釋)基質(zhì)膠購自BD公司，Transwell小室購自Millipore公司，4%多聚甲醛購自谷歌生物公司，5 %結(jié)晶紫購自Sigma公司，AKT和P-AKT抗體(1∶1000稀釋)購自CST公司，二抗HRP標(biāo)記抗兔IgG (1:2000稀釋)購自CST公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞感染:用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)前列腺癌PC-3細(xì)胞。取對數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞，離心后培養(yǎng)基重懸，以5×105細(xì)胞/孔密度接種于含有圓玻片的24孔板。12h細(xì)胞貼壁后加入50μM的DAPT，DMSO作為對照組；或者12h細(xì)胞貼壁后加入AdNICD和AdCtrl對照腺病毒，8h換液，48h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3qRT-PCR:細(xì)胞培養(yǎng)72h后，利用Trizol法提取總RNA，并檢測其濃度和純度。后續(xù)根據(jù)mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。內(nèi)參GAPDH上游引物為：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下游引物為：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'；Hes1上游引物為：5'-AAGAAAGATAGCTCGCGGCAT-3'，下游引物為：5'-CCAGCACACTTGGGTCTGT-3'；Hes5上游引物為：5'-AGCTACCTGAAGCACAGCAAAG-3'，下游引物為：5'-AGGCACCACGAGTAACCCTC-3'。

1.4EdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力:添加DAPT和DMSO或AdNICD和AdControl處理72h后，棄廢舊培養(yǎng)基，根據(jù)EdU試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將A液與培養(yǎng)基按1∶1000稀釋，將配好的培養(yǎng)基加入24孔板，于培養(yǎng)箱中孵育2h。棄培養(yǎng)基，PBS洗三次，加入4%PFA室溫固定30min。棄固定液，加入2%甘氨酸中和，使用Apollo室溫染色30min。染核，封片，熒光顯微鏡下觀察。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.5Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力:DAPT組和DMSO組或AdNICD組和AdCtrl組每組分別設(shè)3個(gè)小室，每小室提前鋪入Matrigel基質(zhì)膠。將處理72h后的PC-3細(xì)胞以1×105/孔的密度接種于Transwell小室中，下層為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后取出小室。4%PFA室溫固定20min，利用5%結(jié)晶紫染色20min，PBS洗三遍，熒光顯微鏡下觀察。

1.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力:DAPT組和DMSO組或AdNICD組和AdCtrl組每組分別以1×106/孔的密度將細(xì)胞接種于六孔板(背面用筆提前畫好直線)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用1mL槍頭垂直于板底和直線劃痕。PBS洗三次，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于0和24h取樣拍照。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.7Western blot檢測蛋白水平變化:使用RIPA裂解法提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1-2h，一抗于4℃孵育過夜，室溫孵育二抗2h，經(jīng)化學(xué)發(fā)光后進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié) 果

2.1qRT-PCR驗(yàn)證DAPT阻斷和AdNICD激活Notch信號通路的效率:通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)對DMSO和DAPT或AdCtrl和AdNICD處理過的前列腺癌PC-3細(xì)胞中的Notch信號通路的下游靶分子Hes1和Hes5的含量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，DAPT加入PC-3細(xì)胞作用72h后，Hes1和Hes5的mRNA水平顯著下調(diào)(圖1A，*P<0.001，#P<0.05)，表明DAPT阻斷Notch信號通路有效。AdNICD作用PC-3細(xì)胞72h后，Hes1和Hes5的mRNA水平顯著上升(圖1B，*P<0.01，#P<0.05)，表明NICD有效激活Notch信號通路。

2.2EdU實(shí)驗(yàn)檢測添加DAPT和AdNICD對PC-3細(xì)胞增殖能力的影響:將PC-3細(xì)胞分為兩組，分別添加DMSO和DAPT或AdNICD和AdCtrl，作用72h后對其進(jìn)行EdU實(shí)驗(yàn)，檢測細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果顯示，添加DAPT作用72h后前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖能力下降(圖2A，P<0.01)；感染AdNICD作用72h后前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)(圖2B，P<0.05)。

圖1 DAPT阻斷或NICD激活Notch信號通路的效率

注：A.前列腺癌PC-3細(xì)胞添加DAPT后，采用qRT-PCR檢測Notch信號通路的下游靶分子Hes1和Hes5的表達(dá)水平變化，驗(yàn)證阻斷Notch信號通路的效率；B.前列腺癌PC-3細(xì)胞感染AdNICD后，采用qRT-PCR檢測Notch信號通路的下游靶分子Hes1和Hes5的表達(dá)水平變化，驗(yàn)證激活Notch信號通路的效率。

圖2 DAPT阻斷或NICD激活Notch信號通路后PC-3細(xì)胞增殖能力變化

注：A.前列腺癌PC-3細(xì)胞添加DAPT后，采用EdU實(shí)驗(yàn)方法檢測細(xì)胞增殖能力變化；B.前列腺癌PC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染AdNICD后，采用EdU實(shí)驗(yàn)方法檢測細(xì)胞增殖能力變化。

2.3Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測添加DAPT和AdNICD對PC-3細(xì)胞侵襲能力的影響:將PC-3細(xì)胞分為兩組，分別添加DMSO和DAPT或AdNICD和AdCtrl，作用72h后對其進(jìn)行transwell小室實(shí)驗(yàn)，檢測細(xì)胞侵襲能力的變化。結(jié)果顯示，DAPT處理后細(xì)胞的侵襲能力減弱(圖3A，P<0.01)；AdNICD感染后細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)(圖3B，P<0.05)。

圖3 DAPT阻斷或NICD激活Notch信號通路后PC-3細(xì)胞侵襲能力變化

注：A.前列腺癌細(xì)胞PC-3添加DAPT后，采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)方法檢測細(xì)胞侵襲能力變化；B.前列腺癌PC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染AdNICD后，采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)方法檢測細(xì)胞侵襲能力變化。

2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測添加DAPT和AdNICD對PC-3細(xì)胞遷移能力的影響:將PC-3細(xì)胞分為兩組，分別添加DMSO和DAPT或AdNICD和AdCtrl，作用72h后對其進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，檢測細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果顯示，DAPT組細(xì)胞遷移能力下降(圖4A，P<0.01)；感染AdNICD后細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)(圖4B，P<0.01)。

圖4 DAPT阻斷或NICD激活Notch信號通路后PC-3細(xì)胞遷移能力變化

注：A.前列腺癌細(xì)胞PC-3添加DAPT后，采用劃痕實(shí)驗(yàn)方法檢測細(xì)胞遷移能力變化；B.前列腺癌PC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染AdNICD后，采用劃痕實(shí)驗(yàn)方法檢測細(xì)胞遷移能力變化。

2.5Western blot檢測添加DAPT和AdNICD作用于PC-3細(xì)胞后AKT信號通路的變化:DAPT和AdNICD分別作用于PC-3細(xì)胞72h后，收集細(xì)胞提取蛋白，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測AKT信號通路分子的表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示，添加DAPT后，細(xì)胞的磷酸化AKT蛋白表達(dá)水平明顯下降，但總AKT蛋白表達(dá)水平無明顯變化(圖5A，P<0.01)；感染AdNICD后，細(xì)胞的磷酸化AKT蛋白表達(dá)水平明顯升高，但總AKT蛋白表達(dá)水平無明顯變化(圖5B，P<0.05)。

圖5 DAPT阻斷或NICD激活Notch信號通路后AKT信號通路相關(guān)分子水平變化

注：A.前列腺癌細(xì)胞PC-3添加DAPT后，采用Western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測AKT信號通路的變化；B.前列腺癌PC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染AdNICD后，采用Western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測AKT信號通路的變化。

3 討 論

前列腺癌目前已經(jīng)成為我國男性的常見疾病，國內(nèi)前列腺癌發(fā)病呈現(xiàn)顯著的地域差異，發(fā)達(dá)地區(qū)發(fā)病率增加尤為顯著，同時(shí)，前列腺癌的生存率較差，尤其是廣大農(nóng)村地區(qū)。國內(nèi)前列腺癌發(fā)病率的增高和人口老齡化、生活方式西方化有關(guān)[5]。前列腺癌在所有癌癥中的預(yù)后最差，2012年在全球癌癥死亡率方面排名第二，有證據(jù)表明這可能是由于前列腺癌更傾向于轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)和骨骼是70～80%前列腺癌相關(guān)死亡病例中轉(zhuǎn)移的目的地。然而，目前缺乏對晚期或轉(zhuǎn)移性前列腺癌的有效治療，導(dǎo)致患者的高死亡率。雄激素剝奪治療是轉(zhuǎn)移性前列腺癌的一線標(biāo)準(zhǔn)治療，但是大部分患者應(yīng)用雄激素治療后2～3年內(nèi)發(fā)展成為趨勢抵抗性前列腺癌[6]。晚期或轉(zhuǎn)移性前列腺癌在臨床上缺乏有效的治療手段，如何提高患者生存率，延長生存期成為前列腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

Notch信號通路在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，調(diào)控紊亂可引起組織發(fā)育異常，可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，對腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、血管生成等過程發(fā)揮重要作用[7]。而具體的致癌或抑癌作用根據(jù)癌癥類型而不同，例如，對腦部腫瘤起始細(xì)胞(brain tumor-initiating cells，BTICs)的研究發(fā)現(xiàn)肌腱蛋白C(Tenascin C，TNC)激活Notch信號通路，從而調(diào)控其增殖和成球能力[8]；關(guān)于三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer ，TNBC)的研究發(fā)現(xiàn)miR-3178靶向調(diào)控Notch1抑制上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal ，EMT)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[9]；另外，Notch1可激活A(yù)KT信號通路，部分通過直接激活主要穹窿蛋白(major vault protein，MVP)促進(jìn)EMT[10]。而在前列腺癌中，已有研究表明Jagged1在晚期前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，Jagged1和Notch1的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的前列腺癌中明顯高于正常前列腺組織和初發(fā)前列腺癌，提示Notch信號通路的激活可能對前列腺癌的發(fā)展具有促進(jìn)作用[11]。

研究表明，阻斷Notch信號通常與前列腺癌的增殖相關(guān)，同時(shí)能夠抑制癌細(xì)胞的克隆球形成能力，促進(jìn)對化療的敏感性，但是對腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲研究較少[12]。Notch信號通路的激活需要γ-分泌酶對受體進(jìn)行切割，γ-分泌酶抑制劑(γ-secretase inhibitor，GSI)DAPT可阻斷Notch信號通路。本研究對前列腺癌PC-3細(xì)胞加入DAPT后，RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示前列腺癌PC-3細(xì)胞的Hes1、Hes5的mRNA水平較對照組明顯下降，提示干預(yù)有效。對細(xì)胞進(jìn)行EdU檢測發(fā)現(xiàn)，DAPT組的細(xì)胞增殖能力減弱，后續(xù)的Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，DAPT組的列腺癌細(xì)胞系PC-3侵襲和遷移能力降低。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DAPT阻斷Notch信號通路后前列腺癌細(xì)胞系PC-3的增殖、侵襲和遷移能力減弱。相反，前列腺癌PC-3細(xì)胞感染過表達(dá)Notch1胞內(nèi)段病毒AdNICD腺病毒后，細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力增強(qiáng)。

Notch信號作用于前列腺癌細(xì)胞的下游分子機(jī)制。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)AKT信號通路與前列腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)，42%的原發(fā)性前列腺癌和所有的轉(zhuǎn)移性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了AKT通路的改變[13]。DAPT阻斷Notch信號通路后，前列腺癌PC-3細(xì)胞的AKT磷酸化水平下降，感染AdNICD激活Notch信號通路后，前列腺癌PC-3細(xì)胞的AKT磷酸化水平升高，我們的研究顯示，阻斷/激活Notch信號分別降低/增加AKT磷酸化水平，提示Notch信號通路調(diào)控前列腺癌細(xì)胞行為可能通過活化AKT通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實(shí)，阻斷/激活Notch信號通路分別抑制/促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3的增殖、侵襲和遷移能力；此外，Notch信號通路激活與AKT磷酸化水平呈正相關(guān)。在前列腺癌細(xì)胞中，Notch信號可能通過調(diào)控AKT信號通路從而影響細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，進(jìn)而影響前列腺癌進(jìn)展。本研究結(jié)果為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行提供了基礎(chǔ)，也為前列腺癌新的分子治療策略提供了理論依據(jù)。