陳 琦, 李石巖, 禹 鑫, 曹 雷, 郝旭峰, 王承陽

(河北省承德市中心醫(yī)院口腔科, 河北 承德 067000)

頜面部作為人體中較為薄弱的抗力部分，其特殊解剖位置和結(jié)構(gòu)重要性一直受到臨床醫(yī)生關(guān)注，而其中由各種原因如外傷、腫瘤等造成其頜面骨缺損的病例也非常多，如受傷后由于操作或修復(fù)不當造成骨不連或愈合延遲等后果也會常常發(fā)生。隨著當今組織工程的迅速發(fā)展，利用多棲生長聚合生長因子復(fù)合支架材料促進成骨一直是臨床及科研中的研究熱點[1,2]。濃縮生長因子由Sacco首次發(fā)現(xiàn)，以患者自身靜脈血為原料，通過特殊的離心方法分離制備的一種修補生物材料，其中含有豐富的生長因子及纖維蛋白，具有改善并增強組織再生的獨特性質(zhì)，是再生醫(yī)療領(lǐng)域中組織刺激的新技術(shù)。本研究將CGF-絲素蛋白羥基磷灰石類骨質(zhì)復(fù)合生物材料進行頜骨缺損修復(fù)，通過X線觀察骨成量，組織學(xué)觀察骨小梁生長情況，評價其在細胞成骨各個階段的體外成骨性能[3,4]。

1 材料與方法

1.1實驗動物:成年健康新西蘭大白兔48只(雌雄不限，八周齡，體重1.5～1.7kg)，由承德醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，材料與儀器：醫(yī)用納米級羥基磷灰石(美國Bio-Rad公司)，絲素蛋白溶液(山東大學(xué)材料學(xué)院提供)，低速臺式離心機，Medifuge小型臺式離心機，低溫冰箱，真空干燥機(日本EiKo公司),掃描電鏡，倒置相差顯微鏡等。

1.2植入材料制備

1.2.1絲素蛋白-羥基磷灰石材料支架材料SF制備:將7.5 wt%絲素蛋白溶液80mL加入120mL含有10.32g納米羥基磷灰石懸濁液中，滴入9.64g 85 wt% H3PO4，最后邊攪拌邊逐滴滴入NH4OH并將pH調(diào)整至9.0,加熱至25℃并保溫3h。反應(yīng)完成后將混合物離心，棄去上清液，取沉淀物去離子水洗。重復(fù)上述過程3遍后，過濾收集濾出物，真空干燥箱50℃干燥48h，先后以陶瓷研缽和瑪瑙研缽仔細研磨。

1.2.2CGF復(fù)合絲素蛋白-羥基磷灰石復(fù)合材料制備:取實驗用動物，20%烏拉坦(5mL/kg)復(fù)合1mg陸眠寧肌注麻醉后，于耳緣靜脈處一次性抽取靜脈血約5mL于負壓離心管內(nèi)，放入Medifuge離心機中，配平后按程序制備CGF。棄上層血清及底層紅細胞后，10%PBS反復(fù)沖洗中層膠狀物即CGF。將CGF壓膜后剪成小片狀與SF材料稱重后等量混合，放入低溫冰箱備用。

1.3手術(shù)分組及實驗方法

1.3.1手術(shù)分組:取健康新西蘭大白兔48只隨機分為三組，每組16只，雌雄不限，八周齡，體重1.5～1.7kg，并于同期制備右側(cè)下頜骨骨缺損模型。其中A組為復(fù)合材料組，于骨缺損模型處植入CGF復(fù)合絲素蛋白-羥基磷灰石材料，B組為羥基磷灰石組于骨缺損模型處植入羥基磷灰石材料，C組為空白組不植入任何材料。

1.3.2實驗方法:取實驗用動物，20%烏拉坦(5mL/kg)復(fù)合1mg陸眠寧肌注麻醉后，常規(guī)行術(shù)區(qū)消毒鋪巾并統(tǒng)一于右側(cè)下頜骨下緣行平行切口，暴露下頜骨骨面，于裂鉆行頜骨缺損模型制備，直徑為1.3cm，深度0.5cm。按照手術(shù)分組植入對應(yīng)材料，嚴密縫合創(chuàng)口后分籠飼養(yǎng)，術(shù)后注射慶大霉素，預(yù)防感染，嚴密觀察動物清醒后狀態(tài)，所有動物分別于2、4、8、12周于耳緣靜脈栓塞處死取材并制備組織標本，每組每次4只。

1.4觀察指標

1.4.1大體觀察:肉眼觀察下頜骨骨缺損區(qū)成骨情況及缺損邊界鈣化狀態(tài)，探針探測愈合面硬度。

1.4.2影像學(xué)檢測及分析:X線檢測下頜骨缺損區(qū)內(nèi)骨形成情況，檢測植入材料與周圍骨邊界結(jié)合狀態(tài)。CBCT檢測骨缺損區(qū)內(nèi)12個不同位點并記錄CT值，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4.3組織學(xué)檢驗:所有實驗動物按照實驗計劃處死后于下頜骨缺損骨邊界周圍3mm處取材后置于4%戊二醛固定24h，常規(guī)脫鈣包埋切片后行HE染色，倒置顯微鏡下觀察新骨形成狀態(tài)和材料降解情況。

1.4.4掃描電鏡檢測:取出兔下頜骨實驗用標本迅速置于40%甲醛水溶液固定24h，梯度乙醇脫水后醋酸異戊酯中置換20min，掃描電鏡檢測骨缺損邊緣與植入材料轉(zhuǎn)歸狀態(tài)，密合情況和生物相容性狀況。

1.4.5計算機圖像分析:實驗用下頜骨標本缺損修復(fù)區(qū)行系統(tǒng)切片后隨機選取6張，每張于200倍鏡下選取6個不同視野，在圖像分析儀下行組織學(xué)狀態(tài)分析，測定新生骨骨小梁面積的所占比例。

1.4.6統(tǒng)計學(xué)檢測:使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，各組間采用方差分析，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1大體觀察:2周時取材后可見A、B組骨缺損處部分材料吸收，材料邊界清楚，探針探診較硬，缺損區(qū)內(nèi)稍有纖維組織生長，C組可見明顯肉芽組織長入，探針較軟。4周時，A組缺損邊界開始模糊，缺損區(qū)內(nèi)材料吸收較為明顯，可見絮狀成骨樣組織生長，B組缺損區(qū)內(nèi)支架材料吸收不甚明顯，邊界清，C組中纖維結(jié)締組織大量生長，探診較軟；8周時，A組材料仍有存在，邊界與周圍骨結(jié)合牢固，新生骨組織開始明顯出現(xiàn)，B組內(nèi)纖維結(jié)締組織與支架材料結(jié)合明顯，邊界清，C組肉芽組織彌漫生長，質(zhì)地軟；12周時，A組可見新骨大量生成，稍有部分材料組織，質(zhì)地堅硬，B組可見表面灰白色組織，大部分材料仍有存在，質(zhì)地較硬，C組有新生骨出現(xiàn)但質(zhì)量不佳(見圖1)。

2.2影像學(xué)檢測分析:2周時，A、B組內(nèi)可見高密度不規(guī)則投射影像，C組低密度影像明顯；4周時A、B組均可見絮狀影像，A組邊界開始出現(xiàn)模糊，B、C組邊界清，低密度影像仍較明顯；8周時，A組缺損區(qū)內(nèi)高密度影像開始均勻，邊界模糊，但仍較正常骨組織影像密度低，B組可見絮狀高密度影，邊界開始出現(xiàn)模糊，C組邊界清，但開始出現(xiàn)絮狀高密度影；12周時，A組可見正常高密度影，邊界已模糊不見，B組材料由部分未降解、高密度絮狀影像增多，C組高密度影像增多，邊界仍較清(見圖2、表1)。

圖1 A、B、C三組12周時大體觀

圖2 A、B、C三組12周時影像學(xué)表現(xiàn)

2.3掃描電鏡檢測:2周時，掃面電鏡下可見A、B組骨缺損區(qū)植入材料均可見，與缺損邊緣界限清楚，裂隙明顯；4周時，A組材料出現(xiàn)部分降解，與周圍邊界開始模糊，B、C組可見絮狀纖維組織長入；8周時，A組植入材料大部分已降解，新生骨開始出現(xiàn)，缺損邊界模糊，B組仍可見大量支架材料，裂隙較多，纖維組織明顯，邊界清楚，C組為彌漫性纖維組織長入，邊界清楚；12周時，A組可見新生骨大量出現(xiàn)，仍有少部分材料未被降解，邊界模糊不清，B組部分材料降解明顯，裂隙較多，新生骨開始出現(xiàn)，C組可見大量裂隙，有部分骨痂纖維組織長入，邊界仍較清晰(圖3、表2)。

圖3 A、B、C三組12周時掃描電鏡下表現(xiàn)

2.4組織學(xué)檢測:2周時，A組缺損區(qū)內(nèi)可見大量新生成骨細胞般纖維結(jié)締組織出現(xiàn)，材料組織明顯，未被降解，B組內(nèi)大量成纖維結(jié)締組織出現(xiàn)，伴部分新生成骨細胞，材料未被降解，C組內(nèi)新生纖維組織明顯，新生成骨細胞少見；4周時，A組可見纖維行骨痂長入，材料部分開始降解伴部分纖維結(jié)締組織，B組內(nèi)成骨細胞生成較少，未降解材料較明顯，可見部分骨髓組織和纖維結(jié)締組織，C組可見大量成纖維組織和部分成骨細胞；8周時，A組可見纖維性骨組織大量出現(xiàn)，骨小梁開始成熟，仍有部分材料未被降解，B組可見大量支架材料，有纖維行骨痂長入伴部分纖維結(jié)締組織，C組可見部分纖維行骨痂，大部分仍為纖維結(jié)締組織；12周時，A組可見成熟骨小梁，材料大部分已被降解，B組仍見部分未降解材料，纖維骨痂出現(xiàn)較多，C組可見纖維性骨小梁開始逐漸增多但仍伴隨大量成纖維狀結(jié)締組織(圖4)。

圖4 三組12周時HE染色

2.5統(tǒng)計分析結(jié)果：通過對各個時間段三組實驗骨缺損區(qū)修復(fù)CT值得測量檢測結(jié)果，比較分析得到：通過A組與其他兩組進行兩兩比較，其CT值明顯高于其他兩組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),詳見表1；通過對各個時間段三組動物實驗標本行新生骨面積檢測可以得出A組新生骨面積占骨缺損面積的百分比明顯高于其他兩組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表1 各組動物各個時間段骨缺損區(qū)CT值比較分析

注：*P<0.05 A組與B組同一時間段相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；#P<0.05 A組與C組同一時間段相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

表2 各組動物各個時間段新生骨面積占骨缺損面積百分比

注：*P<0.05 A組與B組同一時間段相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；#P<0.05 A組與C組同一時間段相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

3 討 論

隨著組織工程及材料科學(xué)的不斷發(fā)展，采用組織工程材料來修復(fù)頜面部的缺損為醫(yī)療臨床工作者們提供了一種新的思路和方法[5]。目前對支架材料的研究已經(jīng)表明絲素蛋白是一種具有良好力學(xué)性能，可在人體內(nèi)吸收降解，具有良好生物相容性的天然高分子蛋白材料。然骨是由膠原( collagen，COL) 和羥基磷灰石 ( hydroxyapatite，HAP) 以及鈣化的細胞外基質(zhì)組成的結(jié)締組織，因此骨組織工程支架應(yīng)該具有一定的韌性和沉積基質(zhì)的能力，作為具有良好生物相容性和降解能力的天然高分子材料，SF/CS 復(fù)合材料在組織工程領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[6]。與第2代的富血小板纖維蛋白相比濃縮生長因子(CGF)作為第三代血液提取物，其轉(zhuǎn)化因子(TGF)、血小板生長因子(PDGF)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等的含量和濃縮程度均更高具有更高的抗張強度、更多的生長因子、更好的黏性和更高的黏合強度制備富自體濃縮生長因子纖維蛋白過程中，特殊的變速離心使得血小板被激活，其中的血小板α顆粒釋放出各種生長因子，主要包括轉(zhuǎn)移生長因子β、血小板衍生生長因子、類胰島素生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子以及成纖維細胞生長因子等，這些因子均能促進細胞增殖、基質(zhì)合成和血管生成，而纖維網(wǎng)狀支架又能支持生長因子所誘導(dǎo)生成的新生組織[7]。

結(jié)合本實驗的研究過程和結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)：A組最終成骨效果明顯優(yōu)于其他兩組，從影像學(xué)和掃描電鏡觀擦下可見A組在第8周時，缺損區(qū)內(nèi)植入材料開始出現(xiàn)明顯降解等狀態(tài)，缺損區(qū)與周圍邊界開始模糊說明了已經(jīng)開始有新生骨長入，促進了材料的降解和吸收，而B組在此時雖有材料出現(xiàn)降解，但是降解程度并不如A組完全，新生骨較少，未與缺損區(qū)周緣形成良好的融合狀態(tài)，所以邊界依然很清楚，通過X線比較也可證實這一點，C組缺損區(qū)內(nèi)未植入任何材料，所有生物生長全靠自身機體組織的自然形成，所以在最初形成的都是些纖維狀的結(jié)締組織，未見明顯的纖維性骨痂形成，成骨較其他兩組能力均較弱，而在12周時我們通過HE染色也可以發(fā)現(xiàn)A組缺損區(qū)內(nèi)已形成了較為完善成熟的骨小梁結(jié)構(gòu)，大量的新生骨促進了植入材料的絕大部分的降解，而B組因為單純?yōu)橹Ъ懿牧系闹踩?，雖然有成熟骨痂組織形成，但形成面積及成熟度均不如A組，C組染色下可見纖維性的結(jié)締組織，雖有成骨，但遠遠弱于其他兩組，邊緣鈣化嚴重。最后經(jīng)過影像學(xué)數(shù)據(jù)及計算機圖像分析結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)意義上的分析得到各組新生骨及骨密度均有增加，但A組明顯優(yōu)于其他兩組，A組材料具有較高成骨性能，具有加速成骨的作用。

本實驗通過對支架材料的制備并結(jié)合富含多種生長因子的濃縮生長因子(CGF)對兔下頜骨缺損區(qū)內(nèi)進行修復(fù)，誘導(dǎo)分化刺激成骨，證明了所選材料所具有的良好生物相容性和相對安全性，但是CGF中的各類生長因子促進成骨效應(yīng)的機制與其濃度的關(guān)系，以及與其他生物材料復(fù)合使用是否成骨效果更佳等問題有待進一步的研究和觀察。