黃翠敏, 葉秀群, 駱月姬

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部, 廣東 廣州 510405)

惡性黑色素瘤是主要發(fā)生于皮膚體表及粘膜的惡性腫瘤，預(yù)后差，易轉(zhuǎn)移，發(fā)病率約占皮膚惡性腫瘤的6.8%～20%，近年來其發(fā)病率增長迅速，且呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅居民身心健康[1]?？喙显碥帐翘崛∽院J科苦瓜屬蔓性草本植物苦瓜的皂苷類物質(zhì)，具有降血糖、抗病毒、抗腫瘤、抗艾滋病、提高免疫力等多種生物活性，可抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2]。苦瓜皂苷可下調(diào)C/EBPβ及TGF-β1表達(dá)，上調(diào)Caspase3及P53表達(dá)，抑制人肺癌A549細(xì)胞的增殖和遷移，并促進(jìn)其凋亡[3]?？喙虾涂喙先~提取物處理大鼠，可抑制胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展，可作為預(yù)防胰腺癌的措施，因而預(yù)計(jì)苦瓜皂苷可抑制人惡性黑素瘤SKMEL-2細(xì)胞的生長。JAK/STAT5信號(hào)可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生理過程，當(dāng)STAT5磷酸化因G6PD缺陷而降低時(shí)，可促進(jìn)人黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡[4,5]。STAT5在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)中起重要的調(diào)節(jié)作用，SR-BI基因缺失可導(dǎo)致STAT5活性降低，抑制黑色素瘤的轉(zhuǎn)移，總之，JAK/STAT5信號(hào)在人黑色素瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，而苦瓜皂苷對(duì)其的影響目前還未知，本文通過苦瓜皂苷處理體外培養(yǎng)的人惡性黑素瘤SKMEL-2細(xì)胞，探討其對(duì)SKMEL-2細(xì)胞生長及JAK/STAT5通路的影響。

1 材料與方法

1.1試劑與材料：SKMEL-2細(xì)胞購自上海名勁生物科技有限公司；苦瓜皂苷購自上海源葉生物科技有限公司；順鉑購自山東齊魯制藥廠；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶-EDTA消化液、100×青鏈霉素混合液購自Solarbio公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、兔源GAPDH、Bax、caspase3一抗，鼠源Bcl-2一抗，羊抗鼠二抗，羊抗兔二抗購自美國Cell Singaling Technology公司；兔源JAK、p-JAK、STAT5、p- STAT5一抗，購自美國Abcam公司；RIPA蛋白裂解液、CKK-8試劑盒、BCA試劑盒購自上海碧云天公司等。

1.2儀器：Elx800酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；雙人單面超凈工作臺(tái)購自Thermo公司；電泳儀、制冰機(jī)購自北京六一儀器廠等。

1.3方 法

1.3.1培養(yǎng)基的配制及細(xì)胞培養(yǎng):完全培養(yǎng)基的配制：向DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、100U/mL青、鏈霉素，上下震蕩混勻。凍存的人惡性黑素瘤SKMEL-2細(xì)胞，于39℃水浴中快速解凍，離心后接種于含5mL完全培養(yǎng)基的25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5%CO2、95%濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長到80%以上時(shí)，以1∶3的比例傳代。

1.3.2CKK-8實(shí)驗(yàn):從前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知苦瓜皂苷在48h的IC50值為4.57mg/mL，因而在篩選合適藥物作用濃度和時(shí)間時(shí)，以5mg/mL為準(zhǔn)，加減2.5mg/mL設(shè)置濃度，分別檢測(cè)人惡性黑素瘤SKMEL-2細(xì)胞在24h、48h、72h的細(xì)胞增殖抑制率，方法如下：以DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解苦瓜皂苷配制為20mg/mL的儲(chǔ)備液備用。1.3.1中的傳代細(xì)胞以6×104個(gè)/mL的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)過夜，向96孔板中加入苦瓜皂苷儲(chǔ)備液處理SKMEL-2細(xì)胞，使終濃度分別為1、2.5、5、7.5、10mg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)孔作為重復(fù)，同時(shí)選定4個(gè)孔設(shè)置為對(duì)照組。藥物作用24、48、72h后每孔加入CKK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2h，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長下各孔吸光度(optical density，OD)，計(jì)算苦瓜皂苷不同濃度對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率，公式為：增殖抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-藥物處理組OD值/對(duì)照組OD值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.3藥物及細(xì)胞處理和分組:順鉑是臨床上常用的治療人惡性黑色素瘤的抗癌藥，在抗腫瘤研究中也常作為陽性對(duì)照藥，本研究即選用順鉑作為陽性對(duì)照，終濃度為5μmoL/L。1.3.1中的傳代細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基重懸混勻后，將其隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、苦瓜皂苷組、順鉑組接種于60mm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2、95%濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后以5mg/mL濃度的苦瓜皂苷、5μmoL/L的順鉑處理細(xì)胞，48h后分別以0.25%胰酶消化后收集各組細(xì)胞備用。

1.3.4細(xì)胞存活率及凋亡情況檢測(cè):1.3.1中的傳代細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基重懸混勻后，將其隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、苦瓜皂苷組、順鉑組以0.6×105個(gè)/mL的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)過夜后，藥物處理SKMEL-2細(xì)胞48h，每孔加入CKK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2h，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長下各孔OD值，計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)存活率，公式為：相對(duì)存活率(%)=藥物處理組OD值/對(duì)照組OD值×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，1.3.3中的各組細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基后，混勻計(jì)數(shù)，取約含有1×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞混懸液至一個(gè)EP管中，1000r/min離心5min，細(xì)胞沉淀以PBS溶液漂洗2次，1000r/min離心5min，細(xì)胞沉淀中加入200μL的Binding Buffer及10μL的ArmexinV-FITC輕輕震蕩，使之充分混勻，室溫下避光反應(yīng)15min，1000r/min離心5min，細(xì)胞沉淀中加入300μL的Binding Buffer和5μLPI輕輕混勻，室溫下避光反應(yīng)15min，1000r/min離心5min，細(xì)胞沉淀中加入PBS后，輕輕震蕩使之成為均勻的單細(xì)胞懸液，然后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用Muticycle AV軟件分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.5免疫印跡(western blot，WB)實(shí)驗(yàn):向1.3.3中的各組細(xì)胞加入RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，以BCA試劑盒測(cè)定蛋白總濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果調(diào)整各組蛋白濃度相同，根據(jù)目的蛋白分子量配制適宜濃度的SDS-PAGE膠，各組取20μg蛋白樣品加入膠孔中，在電泳儀中進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移全部分離蛋白至硝酸纖維膜上，根據(jù)目的蛋白分子量裁剪目的蛋白條帶置于小盒中，加入5%的脫脂奶粉，室溫封閉2h，分別加入適宜濃度的一抗兔源GAPDH、JAK、p-JAK、STAT5、p-STAT5、caspase3抗體，鼠源Bcl-2抗體，4℃孵育過夜，以TBST漂洗3次，根據(jù)一抗種屬分別加入適宜濃度的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗，室溫封閉2h，采用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像儀中觀察并拍攝蛋白條帶，以Image Lab軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2 結(jié) 果

2.1苦瓜皂苷對(duì)SKMEL-2細(xì)胞增殖的影響:苦瓜皂苷對(duì)SKMEL-2細(xì)胞增殖有抑制作用，并和濃度及作用時(shí)間相關(guān)，藥物作用48、72h其抑制作用比24h高，而藥物作用48、72h其抑制作用基本相同；濃度為1、2.5、5、7.5、10mg/mL的苦瓜皂苷都能抑制SKMEL-2增殖，其抑制作用隨濃度升高而增強(qiáng)，但在藥物作用48、72h后，濃度達(dá)到5mg/mL時(shí)抑制作用趨于穩(wěn)定。結(jié)果顯示，5mg/mL的苦瓜皂苷處理SKMEL-2細(xì)胞48h后，其對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)(58.91±4.54)%，見圖1。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇濃度為5mg/mL的苦瓜皂苷處理SKMEL-2細(xì)胞48h來進(jìn)行后續(xù)研究。以5mg/mL濃度的苦瓜皂苷、5μmoL/L的順鉑處理SKMEL-2細(xì)胞48h后，與對(duì)照組比較，苦瓜皂苷組及順鉑組細(xì)胞相對(duì)存活率明顯降低(P<0.05)；苦瓜皂苷組與順鉑組相比，相對(duì)存活率無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。統(tǒng)計(jì)量為：F=73.726，P=0.000。見圖2。

圖1 不同濃度的苦瓜皂苷對(duì)SKMEL-2細(xì)胞增殖的影響

2.3苦瓜皂苷對(duì)SKMEL-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響:與對(duì)照組比較，苦瓜皂苷組及順鉑組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.05)，caspase3、Bax表達(dá)明顯升高(P<0.05)；苦瓜皂苷組與順鉑組相比，各蛋白表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Bcl-2統(tǒng)計(jì)量為：F=44.388，P=0.000；caspase3統(tǒng)計(jì)量為：F=16.537，P=0.004；Bax統(tǒng)計(jì)量為：F=18.003，P=0.003。見圖5、6。

圖2 苦瓜皂苷對(duì)SKMEL-2細(xì)胞相對(duì)存活率的影響

注：A：對(duì)照組；B：苦瓜皂苷組；C：順鉑組。“a”表示與對(duì)照組比較，P<0.05

2.2苦瓜皂苷對(duì)SKMEL-2細(xì)胞凋亡的影響:與對(duì)照組比較，苦瓜皂苷組及順鉑組細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)；苦瓜皂苷組與順鉑組相比，凋亡率無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。統(tǒng)計(jì)量為：F=57.518，P=0.000。見圖3、4。

圖3 苦瓜皂苷對(duì)SKMEL-2細(xì)胞凋亡的影響

圖4 苦瓜皂苷對(duì)SKMEL-2細(xì)胞凋亡率的影響

注：A：對(duì)照組；B：苦瓜皂苷組；C：順鉑組?！癮”表示與對(duì)照組比較，P<0.05

圖5 免疫印跡檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖6 苦瓜皂苷對(duì)SKMEL-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

注：A：對(duì)照組；B：苦瓜皂苷組；C：順鉑組。“a”表示與對(duì)照組比較，P<0.05

2.4苦瓜皂苷對(duì)SKMEL-2細(xì)胞JAK/STAT5通路相關(guān)蛋白的影響:與對(duì)照組比較，苦瓜皂苷組及順鉑組細(xì)胞p-JAK/JAK、p-STAT5/STAT5明顯降低(P<0.05)；苦瓜皂苷組與順鉑組相比，p-JAK/JAK、p-STAT5/STAT5無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。p-JAK/JAK統(tǒng)計(jì)量為：F=11.903，P=0.008；p-STAT5/STAT5統(tǒng)計(jì)量為：F=53.982，P=0.000。見圖7、8。

圖7 免疫印跡檢測(cè)各組細(xì)胞JAK/STAT5通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖8 苦瓜皂苷對(duì)SKMEL-2細(xì)胞JAK/STAT5通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

注：A：對(duì)照組；B：苦瓜皂苷組；C：順鉑組?！癮”表示與對(duì)照組比較，P<0.05

3 討 論

人惡性黑素瘤(MM)的臨床治療包括手術(shù)切除、化療、放療、免疫治療等，根據(jù)病情和腫瘤分期的不同，治療方法的選擇也不同，早期MM治療首選手術(shù)切除，中晚期或具有高危因素的早期MM還應(yīng)輔助化療放療、免疫治療等其他治療手段，但放療、化療易產(chǎn)生耐藥性，且有惡心嘔吐、毛發(fā)脫落、血細(xì)胞減少等各種副作用，因此尋找新的治療方法具有重要的臨床意義[6]。苦瓜總皂苷是從苦瓜中提取的一種皂苷類混合物，其對(duì)腫瘤的生長具有抑制作用，苦瓜提取物能抑制轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的活性，進(jìn)而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，因而預(yù)計(jì)苦瓜皂苷對(duì)人惡性黑素瘤生長具有抑制作用[7]。本文CKK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，苦瓜皂苷可抑制SKMEL-2細(xì)胞增殖，并和濃度及作用時(shí)間相關(guān)，藥物作用48h、72h其抑制作用比24h高，而藥物作用48h、72h其抑制作用基本相同；濃度為1、2.5、5、7.5、10mg/mL的苦瓜皂苷都能抑制SKMEL-2增殖，其抑制作用隨濃度升高而增強(qiáng)，但在藥物作用48h、72h后，濃度達(dá)到5mg/mL時(shí)抑制作用趨于穩(wěn)定，其增殖抑制率達(dá)(58.91±4.54)%，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇濃度為5mg/mL的苦瓜皂苷，以5μmoL/L的順鉑做陽性對(duì)照，處理SKMEL-2細(xì)胞48h來進(jìn)行后續(xù)研究，與control組比較，苦瓜皂苷組及順鉑組細(xì)胞相對(duì)存活率明顯降低，揭示苦瓜皂苷可抑制SKMEL-2增殖，降低其存活率。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體自主調(diào)控的自主、有序的死亡過程，有多種基因及蛋白參與其中，caspase-3、Bcl-2、Bax是和細(xì)胞凋亡相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，激活并上調(diào)caspase-3，可激活下游的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終促使細(xì)胞凋亡；Bcl-2蛋白抑凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2相比Bax表達(dá)較多時(shí)，兩者可結(jié)合形成異源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-2相比Bax表達(dá)較少時(shí)，Bax自身之間會(huì)形成同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。純化后的臍青蛋白可抑制JAK/STAT信號(hào)通路的活性，明顯上調(diào)caspase-3的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡[9]。(2'Z,3'E)-6-溴靛玉紅-3'-肟衍生物(6BIO)可抑制JAK1-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而抑制小鼠B16惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖，可知JAK/STAT5信號(hào)在人惡性黑素瘤的增殖、凋亡中發(fā)揮著重要作用，而苦瓜皂苷對(duì)JAK/STAT5信號(hào)的作用目前還未知，本文研究結(jié)果顯示，與control組比較，苦瓜皂苷組及順鉑組細(xì)胞p-JAK、p-STAT5、Bcl-2表達(dá)明顯降低，細(xì)胞凋亡率、caspase3表達(dá)、Bax表達(dá)明顯升高，JAK、STAT5表達(dá)無明顯變化，表明苦瓜皂苷可以抑制JAK/STAT5信號(hào)的激活，促進(jìn)人黑色素瘤細(xì)胞SKMEL-2的凋亡，揭示下調(diào)JAK/STAT5信號(hào)可能是苦瓜皂苷抑制人黑色素瘤細(xì)胞生長的作用機(jī)制。

綜上所述，苦瓜皂苷可抑制JAK/STAT5信號(hào)激活，上調(diào)caspase-3、Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，抑制人黑色素瘤細(xì)胞SKMEL-2增殖、促進(jìn)其凋亡，但本文未做動(dòng)物體內(nèi)的整體實(shí)驗(yàn)，還存在不足，本文研究結(jié)果表明抑制JAK/STAT5信號(hào)激活可能是苦瓜皂苷抑制人黑色素瘤細(xì)胞生長的作用機(jī)制，但其確切的作用機(jī)制還需使用JAK/STAT5信號(hào)的激動(dòng)劑和抑制劑進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，進(jìn)行深入研究。