李福記 梁靖梅 段秀萍

[摘要] 目的 轉(zhuǎn)錄因子ETS2在器官纖維化的發(fā)生及進(jìn)展中具有重要的作用，研究苦參堿對(duì)其在腹膜間皮細(xì)胞中表達(dá)的影響及其對(duì)腹膜纖維化防治的重要意義。 方法 將人腹膜間皮細(xì)胞按處理方法分為空白對(duì)照組、TGF-β1誘導(dǎo)組、TGF-β1+0.4 mg/mL苦參堿干預(yù)組、TGF-β1+0.8 mg/mL苦參堿干預(yù)組和TGF-β1+1.2 mg/mL苦參堿干預(yù)組，TGF-β1刺激人腹膜間皮細(xì)胞并分別予不同濃度的苦參堿干預(yù)處理，相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)α-SMA和E-cadherin的mRNA表達(dá)水平，然后用mRNA-seq分析ETS2的mRNA表達(dá)水平，相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫蛋白印跡驗(yàn)證ETS2的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果 TGF-β1刺激能上調(diào)人腹膜間皮細(xì)胞ETS2的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，上調(diào)α-SMA的mRNA表達(dá)水平，下調(diào)E-cadherin的mRNA表達(dá)水平;苦參堿能下調(diào)TGF-β1刺激后的ETS2基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平，下調(diào)TGF-β1刺激后α-SMA的mRNA表達(dá)水平和上調(diào)TGF-β1刺激后的E-cadherin的mRNA表達(dá)水平。 結(jié)論 苦參堿通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子ETS2的表達(dá)阻止人腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

[關(guān)鍵詞] 苦參堿;ETS2基因;人腹膜間皮細(xì)胞;間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

[Abstract] Objective The transcription factor ETS2 plays an important role in the occurrence and progress of organ fibrosis. It is important to study the effect of Matrine on its expression in peritoneal mesothelial cells and its prevention and treatment of peritoneal fibrosis. Methods HPMC were divided into blank control group， TGF-β1-induced group， TGF-β1+0.4 mg/mL matrine intervention group， TGF-β1+0.8 mg/mL matrine intervention group and TGF-β1+1.2 mg/mL matrine intervention group， according to different processing methods. TGF-β1 was applied to stimulate HPMC and treated with matrine intervention of different concentrations. The mRNA expression levels of α-SMA and E-cadherin were detected by relative real-time fluorescent quantitative PCR， then the mRNA expression levels of ETS2 were analyzed by mRNA-seq， and the mRNA and protein expression levels of ETS2 were verified by relative real-time fluorescent quantitative PCR and immunoprotein printing. Results TGF-β1 stimulation can up regulate the expression level of ETS2 mRNA and protein， up regulate the expression level of α-SMA， down regulate the expression level of E-cadherin mRNA. Matrine can down regulate the expression level of ETS2 gene mRNA and protein after TGF-β1 stimulation， down regulate the expression level of α-SMA after TGF-β1 stimulation and up regulate the expression level of E-cadherin after TGF-β1 stimulation. Conclusion Matrine can prevent mesenchymal transformation of HPMC by inhibiting the expression of transcription factor ETS2.

[Key words] Matrine; ETS2 gene; Human peritoneal mesothelial cells; Mesenchymal transformation

人腹膜間皮細(xì)胞在終末期腎?。‥nd-stage renal disease，ESRD）患者腹膜透析中具有重要的生物學(xué)功能，長(zhǎng)期腹膜透析過(guò)程中腹膜間皮細(xì)胞不斷受物理和炎癥等刺激會(huì)發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終發(fā)展為腹膜纖維化。由此可見(jiàn)，腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展的早期重要過(guò)程[1]。腹膜透析是ESRD患者重要替代療法之一[2，3]，而腹膜纖維化的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致超濾量下降，患者無(wú)法再進(jìn)行腹膜透析。因此，研究腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制并探索抑制其轉(zhuǎn)分化的相關(guān)藥物，對(duì)防治腹膜纖維化具有重要意義。

轉(zhuǎn)化因子ETS2具有E26轉(zhuǎn)換特異性序列，它能與位于靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特異性核心GGAA/T序列相互作用，并調(diào)控該區(qū)域許多基因的轉(zhuǎn)錄[4，5]。研究證實(shí)ETS2參與多種細(xì)胞功能，包括凋亡、增殖、轉(zhuǎn)化、遷移和血管生成[6，7]。此外，還有許多研究報(bào)道了ETS2通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）和ECM蛋白的表達(dá)參與細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)及影響腫瘤的發(fā)生、創(chuàng)傷的修復(fù)和心血管疾病的發(fā)生[8-10]。近年來(lái)，研究表明ETS2也參與了肺和腎臟等器官纖維化的發(fā)生與發(fā)展[11，12]。本研究ETS2在TGF-β1誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用分子機(jī)制及苦參堿對(duì)其表達(dá)的影響，為尋求有效抑制腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的新方法提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人腹膜間皮細(xì)胞系（HPMC）購(gòu)買于廣州吉賽科技有限公司，苦參堿購(gòu)于北京博奧拓達(dá)科技有限公司（CAS NO：16837-52-8），ETS2、α-SMA和E-cadherin單克隆抗體購(gòu)于CST公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組? 將人腹膜間皮細(xì)胞按照不同處理方法分為空白對(duì)照組（完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）、TGF-β1誘導(dǎo)組（給予5 ng/mL TGF-β1刺激48 h）、TGF-β1+0.4 mg/mL苦參堿干預(yù)組（給予5 ng/mL TGF-β1+0.4 mg/mL苦參堿處理48 h）、TGF-β1+0.8 mg/mL苦參堿干預(yù)組（給予5 ng/mL TGF-β1+0.8 mg/mL苦參堿處理48 h）和TGF-β1+1.2 mg/mL苦參堿干預(yù)組（給予5 ng/mL TGF-β1+1.2 mg/mL苦參堿處理48 h）。

1.2.2 人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)? 復(fù)蘇細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)胰酶消化，接種于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞EMT的TGF-β1濃度為5 ng/mL，苦參堿干預(yù)處理的濃度分別為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.2 mg/mL。

1.2.3 相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）和免疫蛋白印跡? RT-PCR：細(xì)胞干預(yù)處理48 h后收集細(xì)胞，根據(jù)天根RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度與純度，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證完整性后，根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成單鏈cDNA，以cDNA為模板在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增目的片段。擴(kuò)增引物在Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)中在線設(shè)計(jì)，送上海生物工程股份有限公司進(jìn)行合成（序列見(jiàn)表1）。免疫蛋白印跡：收集細(xì)胞提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，抗原封閉1 h后，4℃孵育一抗過(guò)夜，二抗孵育1 h，全能型凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.2.4 mRNA-seq分析? 樣品提取總RNA后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer，使其片斷成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二鏈，經(jīng)過(guò)Quick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測(cè)序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作，構(gòu)建好的文庫(kù)用Illumina HiSeq 2000進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;柱狀圖采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin和α-SMA的mRNA表達(dá)水平的影響

5 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)予0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.2 mg/mL濃度苦參堿干預(yù)處理48 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)E-cadherin和α-SMA的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，5 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞48 h后發(fā)現(xiàn)E-cadherin的mRNA表達(dá)下調(diào)，而α-SMA的mRNA表達(dá)上調(diào);低、中和高濃度苦參堿干預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)E-cadherin的mRNA表達(dá)上調(diào)，而α-SMA的mRNA表達(dá)下調(diào)。見(jiàn)表2。

2.2 mRNA-seq分析ETS2的mRNA表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、TGF-β1誘導(dǎo)組和0.8 mg/mL苦參堿干預(yù)組處理細(xì)胞48 h后提取總RNA送公司進(jìn)行mRNA-seq結(jié)果顯示TGF-β1誘導(dǎo)能顯著上調(diào)ETS2，而苦參堿干預(yù)后能顯著下調(diào)ETS2的mRNA表達(dá)水平。見(jiàn)表3。

2.3 RT-PCR和免疫蛋白印跡分別驗(yàn)證ETS2的mRNA和蛋白的表達(dá)水平

5 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)予0.8 mg/mL苦參堿干預(yù)48 h后發(fā)現(xiàn)ETS2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，同時(shí)給予0.8 mg/mL苦參堿干預(yù)處理能顯著下調(diào)其mRNA和蛋白表達(dá)水平。見(jiàn)圖1、表4。

3 討論

腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在腹膜纖維化的發(fā)生與發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用，研究其分子機(jī)制并探索有效抑制其間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的藥物具有重要意義。研究表明，TGF-β1能誘導(dǎo)小鼠腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]，是導(dǎo)致腹膜纖維化的主要因子之一[14]。本研究通過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，研究結(jié)果顯示TGF-β1能下調(diào)人腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)水平和上調(diào)人腹膜間皮細(xì)胞α-SMA的表達(dá)水平。另外，還發(fā)現(xiàn)了苦參堿能通過(guò)上調(diào)E-cadherin的表達(dá)水平和下調(diào)α-SMA的表達(dá)水平對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化具有明顯抑制作用。

研究表明，TGF-β1刺激人腹膜間皮細(xì)胞后會(huì)激活Smad依賴和非依賴信號(hào)通路，其中Smad依賴信號(hào)通路主要通過(guò)磷酸化其關(guān)鍵因子Smad2和Smad3，再與Smad4形成異二聚體，然后進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄;而Smad非依賴信號(hào)通路主要是TGF-β1與其受體結(jié)合后通過(guò)激活ERK1/2、JNK和PI3K/Akt等信號(hào)通路繼而調(diào)控腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)基因表達(dá)[14]。ETS2作為ERK1/2信號(hào)通路的下游因子，在腎和肺等器官中的致纖維化作用已有研究報(bào)道[11，12]，Yao F等[12]研究認(rèn)為TGF-β1與其受體結(jié)合后會(huì)使ERK1/2磷酸化，磷酸化后的ERK1/2再作用于轉(zhuǎn)錄因子ETS2，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)使腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。然而，目前ETS2在腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及腹膜纖維化中的作用并未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道，本研究結(jié)果顯示TGF-β1能通過(guò)下調(diào)E-cadherin的表達(dá)水平和上調(diào)α-SMA的表達(dá)水平，誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并通過(guò)mRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)TGF-β1刺激人腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化后，ETS2的表達(dá)顯著上調(diào)，提示ETS2在腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中也起著重要作用;研究結(jié)果還顯示了苦參堿能有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)后ETS2的異常高表達(dá)。這些研究結(jié)果提示，苦參堿可能是通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子ETS2的表達(dá)來(lái)調(diào)控腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而阻止腹膜纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

苦參堿是一種具有解熱鎮(zhèn)痛、抑菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、強(qiáng)心、降壓、提高機(jī)體免疫力等功效的生物堿。研究表明，其在肝、肺和心臟等器官纖維化中具有抗纖維化的作用[15-17]。本研究結(jié)果提示苦參堿在抑制腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和抗腹膜纖維化中也具有重要作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1能誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)苦參堿能通過(guò)上調(diào)E-cadherin的表達(dá)和下調(diào)α-SMA和ETS2的表達(dá)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，提示苦參堿可能抑制轉(zhuǎn)錄因子ETS2基因的表達(dá)來(lái)阻止人腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，最終防止腹膜纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

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（收稿日期：2019-11-27）