趙志紅，廖桂祥，楊紅麗，龔龍，陳善義，李先明

深圳市人民醫(yī)院腎科1、放療科2，廣東 深圳 518020

放射治療是頭頸部腫瘤及腦轉(zhuǎn)移瘤的一種重要治療手段。然而在腫瘤的放射治療過程中，其周圍正常組織會受到放射導致不同程度的損害[1]。文獻報道放射性腦病發(fā)生率為0.5%～25.0%[2]，放療半年后約90%的患者會出現(xiàn)以非文字記憶、空間記憶、注意力及學習能力的下降為表現(xiàn)的認知功能損害[3]，更有2%～5%的患者出現(xiàn)記憶力喪失、癡呆、共濟失調(diào)[2]。放射腦損傷及放射導致的認知功能障礙嚴重影響腫瘤患者的生活質(zhì)量，可見，尋找有效的藥物防治放射性腦損傷具有重要意義。

目前，放射腦損傷的具體病理生理及分子機制并未明確，有效防治放射腦損傷的藥物仍未廣泛應(yīng)用，因此研究放射腦損傷的分子機制和尋找有效的防治放射腦損傷的藥物是國內(nèi)外研究的熱點之一。萊菔硫烷(SFN)具有抗氧化應(yīng)激和抗炎的功效[4]，可以保護氧化應(yīng)激導致的腎損傷及其他器官的損傷。SFN 對放射導致的腦損傷是否有保護作用國內(nèi)外未見報道。本研究利用成年斑馬魚放射損傷模型[5]研究SFN能否減輕放射損傷及其具體的作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年野生型AB系斑馬魚購自廣東省人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選中心。斑馬魚飼養(yǎng)條件如下：飼養(yǎng)水利用紫外燈進行實時凈水消毒，pH 值維持7.0 左右，水溫保持在(28±1)℃，光照與黑暗時間為14/10 h交替循環(huán)。斑馬魚90條采用隨機數(shù)表法分為正常組(常數(shù)組數(shù)據(jù)均為1)、照射組和照射+SFN治療組(SFN組)，每組30條。

1.2 主要試劑及設(shè)備 活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)和超氧歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成)，核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和血紅素加氧合酶1(HO-1)抗體(cell signal technology company)，SFN (Abcam)，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連塔克拉生物公司)、quantitative RT-PCR 實時熒光定量試劑盒(大連塔克拉生物公司)，直線加速器(美國VARIAN 2300EX)。

1.3 照射和給藥方法 斑馬魚照射劑量為30 Gy，單次頭部照射。斑馬魚身體其他部位用擋鉛進行保護。照射時斑馬魚用0.01%MS-222 麻醉。SFN 給藥采用腹腔注射，劑量為5 mg/kg，共3 d。

1.4 獲取斑馬魚腦組織 采用0.01%MS-222麻醉劑對斑馬魚進行麻醉并處死，操作在冰上進行，利用解剖顯微鏡下采用顯微解剖鑷將斑馬魚腦組織解剖出來，腦組織用于實驗研究使用。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)獲取腦組織RNA，在Nannodrop分光光度計下測RNA濃度，符合條件的RNA 來進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照試劑盒廠家提供的說明書的詳細操作步驟進行，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板，QRT-PCR 的引物序列如表1所示。

1.6 免疫印跡檢測腦組織中Nrf2 和HO-1 蛋白水平 取斑馬魚腦組織冰凍條件下研磨，用常規(guī)細胞裂解液后獲取蛋白，離心后用BCA法測定蛋白濃度。配膠，取30 μg蛋白加熱變性，上樣，行電泳檢測。70 V電壓30 min后轉(zhuǎn)110 V電壓，切膠轉(zhuǎn)膜，在60 V電壓轉(zhuǎn)2 h，后行封閉，Nrf2 和HO-1 一抗(1∶200 稀釋度)敷1 h，用TBST 洗脫次，每次15 min，二抗(1∶1 000 稀釋度)敷育后洗脫，化學發(fā)光，顯影，定影。選用β-actin作為內(nèi)參照，并采用圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0 軟件，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x-±s)描述，完全隨機設(shè)計資料的方差分析(One-Way ANOVA)用于比較多組樣本均數(shù)的比較。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SFN減輕氧化應(yīng)激損傷 應(yīng)用ROS試劑盒、MDA及SOD檢測試劑盒檢測藥物干預后24 h氧化損傷的情況。如圖1所示，與照射組相比，SFN治療減少了ROS[相對倍數(shù)改變：(1.56±0.17)vs(2.13±0.24)]和MDA[相對倍數(shù)改變：(1.77±0.13)vs(3.28±0.25)]的產(chǎn)生(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。SFN提高了SOD[相對倍數(shù)改變：(1.83±0.22)vs(0.65±0.14)]的水平，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 SFN治療減緩放射導致的氧化應(yīng)激損傷

2.2 SFN提高HO-1基因表達水平 通過QRT-PCR的方法檢測Nrf2 和HO-1 基因的表達情況。如圖2 所示，與照射組相比，SFN組可以提高HO-1基因的表達[相對倍數(shù)改變：(2.41±0.25))vs(1.19±0.14)]，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而在各組中Nrf2 的基因表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.3 SFN 提高細胞核內(nèi)的Nrf2 蛋白和HO-1 蛋白表達水平 相關(guān)文獻證明，Nrf2核內(nèi)的轉(zhuǎn)移提高了Nrf2轉(zhuǎn)錄活性。如圖3所示，SFN顯著提高Nrf2 核內(nèi)轉(zhuǎn)錄[相對倍數(shù)改變：(2.07±0.38)vs(1.2±0.34)，P＜0.05，圖3A]。放射損傷也可以增加Nrf2 的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，然而照射組中其核內(nèi)Nrf2水平顯著低于SFN組。另外，在SFN組中，其HO-1的蛋白水平也顯著高于照射組[相對倍數(shù)改變：(2.36±0.43) vs (1.40±0.18)，P＜0.05，圖3C]。SFN激活了Nrf2/HO-1通路，減緩放射導致的氧化應(yīng)激損傷。

圖2 SFN治療對Nf2和HO-1基因水平的影響

圖3 SFN治療對Nf2核內(nèi)蛋白水平和HO-1蛋白水平的影響

3 討論

SFN 具有抗氧化應(yīng)激和抗炎功效，可以拮抗多種因素導致的組織和器官損傷。SFN 應(yīng)用于放射性腦損傷的研究未見國內(nèi)外文獻報道。

氧化應(yīng)激損傷是放射損傷的主要機制之一。正常組織或器官接受輻射后，立即導致氧化應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)生，導致持續(xù)的ROS 生成，從而產(chǎn)生大量自由基。這些自由基直接損傷機體的DNA，使細胞發(fā)生改變，進而造成機體損傷。另一方面，隨著損傷的增加，機體清除自由基的能力逐漸下降。

SFN 治療可以減輕放射后斑馬魚腦組織ROS 的產(chǎn)生，從而減緩放射損傷。作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一的MDA可反映組織的損傷程度，其水平越高，表明組織損傷越重。SFN 治療后顯著減少MDA 水平，從而證實SFN具有減緩放射損傷的作用。另外，SFN還提高體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中各種抗氧化物質(zhì)的水平和活力。通過檢測，SFN提高了放射后斑馬魚腦組織中的SOD蛋白活力和抗氧化應(yīng)激能力，從而有效地拮抗放射導致的氧化應(yīng)激損傷。不少文獻報道了利用抗氧化物質(zhì)拮抗氧化應(yīng)激可以減輕放射損傷。國外學者發(fā)現(xiàn)用具有抗氧化功能的中藥(塞普蒂林)可以減少ROS 和MDA 的水平、提高SOD 活力[6]。另外，在放射導致的大鼠氧化應(yīng)激損傷模型中，在輻射之前應(yīng)用一種草藥龍血樹進行干預，發(fā)現(xiàn)龍血樹干預可以顯著減少放射性大鼠損傷的ROS的水平、減少MDA的水平、提高了SOD的活力，從而起到減緩放射損傷的功效[7]，與本研究結(jié)果類似。在接受輻射后的小膠質(zhì)細胞中，應(yīng)用拮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的激動劑可以抑制環(huán)氧化合酶-2 和MCP-1 蛋白的上升，抑制炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α和白介素1β的mRNA 水平，抑制核內(nèi)NF-κB的蛋白水平，從而減輕放射損傷[8-9]。

抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2-ARE)為機體的主要抗氧化通路之一，Nrf2(核因子E2 相關(guān)因子2)是一種重要的轉(zhuǎn)錄激活劑。激活Nrf2-ARE可以拮抗各種因素導致的氧化應(yīng)激損傷。Nrf2 通路的激活在保護心血管、腎及各種組織損傷中起重要作用。在缺血性心臟病中，Nrf2 激活可以有效的防止心臟的進一步損傷[10]。在急性腎損傷模型中，通過藥物激活Nrf2，可以減輕ROS的產(chǎn)生、抑制炎癥反應(yīng)，從而有效減輕腎損傷，起到保護腎功能的作用[11]。同樣，在大鼠腸道上皮中，激活Nrf2通路也可以減輕腸道的放射損傷，缺失Nrf2則可以加重放射損傷[12]。HO-1 也是機體內(nèi)的一種重要抗氧化蛋白，具有較強的抗氧化能力，能對各種因素導致的氧化應(yīng)激和炎癥造成的機體損傷起保護作用。HO-1的細胞保護作用(抗氧化、抗炎)也在各種各樣的疾病模型中得到驗證，例如帕金森病、急性腎損傷、缺血性腦損傷[13-14]。在創(chuàng)傷性腦損傷小鼠模型中，研究者證實激活Nrf2/HO-1 通路可以減輕損傷[15]，也證實了在放射性腦損傷中，激活Nrf2/HO-1 可以減輕損傷。另外，本實驗發(fā)現(xiàn)SFN 增加了核內(nèi)的Nrf2 水平，而總Nrf2水平未見明顯改變。因為Nrf2為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。KIM等[16]也證實了通過藥物可以增加Nrf2核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、維持Nrf2 總蛋白的穩(wěn)定，而Nrf2 基因的表達水平未受影響。KIM 等[12]的研究也得到類似結(jié)果。在放射誘導的放射性肺纖維化的小鼠模型中，通過藥物激活Nrf2 可以抑制轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)介導的信號通路，有效的減緩放射性肺纖維化的產(chǎn)生。接受了胸部照射的Nrf2 基因敲除的小鼠或Nrf2 基因異質(zhì)性的小鼠其平均生存時間為176 d，而接受了胸部照射的野生型Nrf2 小鼠其平均生存時間為212 d[17]。這也表明Nrf2 在放射性損傷中起著重要的作用，也有研究者證實通過藥物激活了Nrf2 通路，可以減輕全身照射小鼠的胃腸道和血液系統(tǒng)損傷，提高小鼠的總存活率[18]。

綜上所述，SFN 通過激活Nrf2/HO-1 信號通路減輕斑馬魚的放射腦損傷。