趙志紅，廖桂祥，楊紅麗，龔龍，陳善義，李先明

深圳市人民醫(yī)院腎科1、放療科2，廣東 深圳 518020

放射治療是頭頸部腫瘤及腦轉(zhuǎn)移瘤的一種重要治療手段。然而在腫瘤的放射治療過(guò)程中，其周?chē)＝M織會(huì)受到放射導(dǎo)致不同程度的損害[1]。文獻(xiàn)報(bào)道放射性腦病發(fā)生率為0.5%～25.0%[2]，放療半年后約90%的患者會(huì)出現(xiàn)以非文字記憶、空間記憶、注意力及學(xué)習(xí)能力的下降為表現(xiàn)的認(rèn)知功能損害[3]，更有2%～5%的患者出現(xiàn)記憶力喪失、癡呆、共濟(jì)失調(diào)[2]。放射腦損傷及放射導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重影響腫瘤患者的生活質(zhì)量，可見(jiàn)，尋找有效的藥物防治放射性腦損傷具有重要意義。

目前，放射腦損傷的具體病理生理及分子機(jī)制并未明確，有效防治放射腦損傷的藥物仍未廣泛應(yīng)用，因此研究放射腦損傷的分子機(jī)制和尋找有效的防治放射腦損傷的藥物是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。萊菔硫烷(SFN)具有抗氧化應(yīng)激和抗炎的功效[4]，可以保護(hù)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的腎損傷及其他器官的損傷。SFN 對(duì)放射導(dǎo)致的腦損傷是否有保護(hù)作用國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用成年斑馬魚(yú)放射損傷模型[5]研究SFN能否減輕放射損傷及其具體的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年野生型AB系斑馬魚(yú)購(gòu)自廣東省人類(lèi)疾病斑馬魚(yú)模型與藥物篩選中心。斑馬魚(yú)飼養(yǎng)條件如下：飼養(yǎng)水利用紫外燈進(jìn)行實(shí)時(shí)凈水消毒，pH 值維持7.0 左右，水溫保持在(28±1)℃，光照與黑暗時(shí)間為14/10 h交替循環(huán)。斑馬魚(yú)90條采用隨機(jī)數(shù)表法分為正常組(常數(shù)組數(shù)據(jù)均為1)、照射組和照射+SFN治療組(SFN組)，每組30條。

1.2 主要試劑及設(shè)備 活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)和超氧歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成)，核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和血紅素加氧合酶1(HO-1)抗體(cell signal technology company)，SFN (Abcam)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連塔克拉生物公司)、quantitative RT-PCR 實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(大連塔克拉生物公司)，直線加速器(美國(guó)VARIAN 2300EX)。

1.3 照射和給藥方法 斑馬魚(yú)照射劑量為30 Gy，單次頭部照射。斑馬魚(yú)身體其他部位用擋鉛進(jìn)行保護(hù)。照射時(shí)斑馬魚(yú)用0.01%MS-222 麻醉。SFN 給藥采用腹腔注射，劑量為5 mg/kg，共3 d。

1.4 獲取斑馬魚(yú)腦組織 采用0.01%MS-222麻醉劑對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行麻醉并處死，操作在冰上進(jìn)行，利用解剖顯微鏡下采用顯微解剖鑷將斑馬魚(yú)腦組織解剖出來(lái)，腦組織用于實(shí)驗(yàn)研究使用。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)獲取腦組織RNA，在Nannodrop分光光度計(jì)下測(cè)RNA濃度，符合條件的RNA 來(lái)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照試劑盒廠家提供的說(shuō)明書(shū)的詳細(xì)操作步驟進(jìn)行，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板，QRT-PCR 的引物序列如表1所示。

1.6 免疫印跡檢測(cè)腦組織中Nrf2 和HO-1 蛋白水平 取斑馬魚(yú)腦組織冰凍條件下研磨，用常規(guī)細(xì)胞裂解液后獲取蛋白，離心后用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配膠，取30 μg蛋白加熱變性，上樣，行電泳檢測(cè)。70 V電壓30 min后轉(zhuǎn)110 V電壓，切膠轉(zhuǎn)膜，在60 V電壓轉(zhuǎn)2 h，后行封閉，Nrf2 和HO-1 一抗(1∶200 稀釋度)敷1 h，用TBST 洗脫次，每次15 min，二抗(1∶1 000 稀釋度)敷育后洗脫，化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。選用β-actin作為內(nèi)參照，并采用圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0 軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)描述，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析(One-Way ANOVA)用于比較多組樣本均數(shù)的比較。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFN減輕氧化應(yīng)激損傷 應(yīng)用ROS試劑盒、MDA及SOD檢測(cè)試劑盒檢測(cè)藥物干預(yù)后24 h氧化損傷的情況。如圖1所示，與照射組相比，SFN治療減少了ROS[相對(duì)倍數(shù)改變：(1.56±0.17)vs(2.13±0.24)]和MDA[相對(duì)倍數(shù)改變：(1.77±0.13)vs(3.28±0.25)]的產(chǎn)生(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。SFN提高了SOD[相對(duì)倍數(shù)改變：(1.83±0.22)vs(0.65±0.14)]的水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 SFN治療減緩放射導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷

2.2 SFN提高HO-1基因表達(dá)水平 通過(guò)QRT-PCR的方法檢測(cè)Nrf2 和HO-1 基因的表達(dá)情況。如圖2 所示，與照射組相比，SFN組可以提高HO-1基因的表達(dá)[相對(duì)倍數(shù)改變：(2.41±0.25))vs(1.19±0.14)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而在各組中Nrf2 的基因表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 SFN 提高細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2 蛋白和HO-1 蛋白表達(dá)水平 相關(guān)文獻(xiàn)證明，Nrf2核內(nèi)的轉(zhuǎn)移提高了Nrf2轉(zhuǎn)錄活性。如圖3所示，SFN顯著提高Nrf2 核內(nèi)轉(zhuǎn)錄[相對(duì)倍數(shù)改變：(2.07±0.38)vs(1.2±0.34)，P＜0.05，圖3A]。放射損傷也可以增加Nrf2 的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，然而照射組中其核內(nèi)Nrf2水平顯著低于SFN組。另外，在SFN組中，其HO-1的蛋白水平也顯著高于照射組[相對(duì)倍數(shù)改變：(2.36±0.43) vs (1.40±0.18)，P＜0.05，圖3C]。SFN激活了Nrf2/HO-1通路，減緩放射導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。

圖2 SFN治療對(duì)Nf2和HO-1基因水平的影響

圖3 SFN治療對(duì)Nf2核內(nèi)蛋白水平和HO-1蛋白水平的影響

3 討論

SFN 具有抗氧化應(yīng)激和抗炎功效，可以拮抗多種因素導(dǎo)致的組織和器官損傷。SFN 應(yīng)用于放射性腦損傷的研究未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。

氧化應(yīng)激損傷是放射損傷的主要機(jī)制之一。正常組織或器官接受輻射后，立即導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)生，導(dǎo)致持續(xù)的ROS 生成，從而產(chǎn)生大量自由基。這些自由基直接損傷機(jī)體的DNA，使細(xì)胞發(fā)生改變，進(jìn)而造成機(jī)體損傷。另一方面，隨著損傷的增加，機(jī)體清除自由基的能力逐漸下降。

SFN 治療可以減輕放射后斑馬魚(yú)腦組織ROS 的產(chǎn)生，從而減緩放射損傷。作為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物之一的MDA可反映組織的損傷程度，其水平越高，表明組織損傷越重。SFN 治療后顯著減少M(fèi)DA 水平，從而證實(shí)SFN具有減緩放射損傷的作用。另外，SFN還提高體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中各種抗氧化物質(zhì)的水平和活力。通過(guò)檢測(cè)，SFN提高了放射后斑馬魚(yú)腦組織中的SOD蛋白活力和抗氧化應(yīng)激能力，從而有效地拮抗放射導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。不少文獻(xiàn)報(bào)道了利用抗氧化物質(zhì)拮抗氧化應(yīng)激可以減輕放射損傷。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)用具有抗氧化功能的中藥(塞普蒂林)可以減少ROS 和MDA 的水平、提高SOD 活力[6]。另外，在放射導(dǎo)致的大鼠氧化應(yīng)激損傷模型中，在輻射之前應(yīng)用一種草藥龍血樹(shù)進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)龍血樹(shù)干預(yù)可以顯著減少放射性大鼠損傷的ROS的水平、減少M(fèi)DA的水平、提高了SOD的活力，從而起到減緩放射損傷的功效[7]，與本研究結(jié)果類(lèi)似。在接受輻射后的小膠質(zhì)細(xì)胞中，應(yīng)用拮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的激動(dòng)劑可以抑制環(huán)氧化合酶-2 和MCP-1 蛋白的上升，抑制炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α和白介素1β的mRNA 水平，抑制核內(nèi)NF-κB的蛋白水平，從而減輕放射損傷[8-9]。

抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2-ARE)為機(jī)體的主要抗氧化通路之一，Nrf2(核因子E2 相關(guān)因子2)是一種重要的轉(zhuǎn)錄激活劑。激活Nrf2-ARE可以拮抗各種因素導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。Nrf2 通路的激活在保護(hù)心血管、腎及各種組織損傷中起重要作用。在缺血性心臟病中，Nrf2 激活可以有效的防止心臟的進(jìn)一步損傷[10]。在急性腎損傷模型中，通過(guò)藥物激活Nrf2，可以減輕ROS的產(chǎn)生、抑制炎癥反應(yīng)，從而有效減輕腎損傷，起到保護(hù)腎功能的作用[11]。同樣，在大鼠腸道上皮中，激活Nrf2通路也可以減輕腸道的放射損傷，缺失Nrf2則可以加重放射損傷[12]。HO-1 也是機(jī)體內(nèi)的一種重要抗氧化蛋白，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能對(duì)各種因素導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和炎癥造成的機(jī)體損傷起保護(hù)作用。HO-1的細(xì)胞保護(hù)作用(抗氧化、抗炎)也在各種各樣的疾病模型中得到驗(yàn)證，例如帕金森病、急性腎損傷、缺血性腦損傷[13-14]。在創(chuàng)傷性腦損傷小鼠模型中，研究者證實(shí)激活Nrf2/HO-1 通路可以減輕損傷[15]，也證實(shí)了在放射性腦損傷中，激活Nrf2/HO-1 可以減輕損傷。另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SFN 增加了核內(nèi)的Nrf2 水平，而總Nrf2水平未見(jiàn)明顯改變。因?yàn)镹rf2為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。KIM等[16]也證實(shí)了通過(guò)藥物可以增加Nrf2核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、維持Nrf2 總蛋白的穩(wěn)定，而Nrf2 基因的表達(dá)水平未受影響。KIM 等[12]的研究也得到類(lèi)似結(jié)果。在放射誘導(dǎo)的放射性肺纖維化的小鼠模型中，通過(guò)藥物激活Nrf2 可以抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)介導(dǎo)的信號(hào)通路，有效的減緩放射性肺纖維化的產(chǎn)生。接受了胸部照射的Nrf2 基因敲除的小鼠或Nrf2 基因異質(zhì)性的小鼠其平均生存時(shí)間為176 d，而接受了胸部照射的野生型Nrf2 小鼠其平均生存時(shí)間為212 d[17]。這也表明Nrf2 在放射性損傷中起著重要的作用，也有研究者證實(shí)通過(guò)藥物激活了Nrf2 通路，可以減輕全身照射小鼠的胃腸道和血液系統(tǒng)損傷，提高小鼠的總存活率[18]。

綜上所述，SFN 通過(guò)激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路減輕斑馬魚(yú)的放射腦損傷。