姚海蘭，宋娟，王欣玲，王瑞芳，宋芹芹，史冰田，韓俊

1. 首都兒科研究所生物化學(xué)與免疫室， 北京 100020； 2. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 102206

柯薩奇病毒(Coxsackie virus, CV)是微小RNA病毒科腸道病毒屬的單股正鏈RNA病毒，可分為A(Coxsackie virus groups A, CVA)和B(Coxsackie virus groups B, CVB)兩組。CVA分為23個(gè)型別，CVA1～23；CVB分為6個(gè)型別，CVB1～6。其中，柯薩奇病毒B3型(Coxsackie virus B3, CVB3)是引起人類病毒性心肌炎的重要病原體之一[1]。

目前，已有確鑿證據(jù)表明，病毒來(lái)源的小RNA (viral small RNA，vsRNA)存在于哺乳動(dòng)物。在微小RNA病毒科病毒感染的宿主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了2種vsRNA，1種是病毒來(lái)源的小干擾RNA (virus-derived small interfering RNA，vsiRNA)，它是在RNA復(fù)制過(guò)程中由病毒雙鏈RNA中間體加工而成；另1種來(lái)自高度堿基配對(duì)的單鏈基因組區(qū)域的小RNA，例如微小RNA病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(internal ribosome entry site, IRES)。微小RNA病毒科病毒，如腦心肌炎病毒、腸道病毒A71 (EV-A71)和脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)等，均已被證實(shí)可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生病毒衍生小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA )，即vsiRNA[2-5]。

病毒基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中產(chǎn)生一些雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)[6]。而宿主細(xì)胞質(zhì)中的RNA內(nèi)切酶Dicer可迅速針對(duì)dsRNA發(fā)生反應(yīng)，將其切割成多個(gè)特定小片段RNA(21～23 bp)，此為外源性siRNA(exogenous siRNA，exo-siRNA)[7-8]。siRNA也來(lái)源于細(xì)胞基因組產(chǎn)生的信使RNA(messenger RNA，mRNA)轉(zhuǎn)錄物、假基因衍生的反義轉(zhuǎn)錄物的雙鏈體和發(fā)夾RNA(hairpin RNA，hpRNA)[7,9]。

siRNA與 Argonaute(AGO)蛋白家族相互作用，通過(guò)RNA干擾(RNA interference，RNAi)過(guò)程控制病毒RNA的復(fù)制。siRNA在RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之反義鏈與解旋酶、內(nèi)外切酶等結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)[6]。RISC與外源基因表達(dá)的mRNA同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合。由于RISC具有核酸酶的功能，可在與siRNA 反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端切割mRNA，使其降解。此外，siRNA可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解[6,9]。siRNA在基因轉(zhuǎn)錄后修飾、抗病毒感染等方面發(fā)揮了重要作用[7,10-12]。本研究通過(guò)小RNA高通量測(cè)序，了解CVB3感染是否誘導(dǎo)內(nèi)源性siRNA的產(chǎn)生，期望為進(jìn)一步研究CVB3感染對(duì)siRNA表達(dá)的影響及其作用機(jī)制以及是否通過(guò)siRNA影響病毒復(fù)制等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

HeLa細(xì)胞和CVB3由本實(shí)驗(yàn)室保存，細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 CVB3感染HeLa細(xì)胞 HeLa細(xì)胞以6×106/孔傳至6孔板，過(guò)夜培養(yǎng)至細(xì)胞密度為90%。CVB3(MOI=5)接種HeLa細(xì)胞，細(xì)胞在培養(yǎng)箱(5% CO2、37 ℃)孵育1 h。隨后加入含2%血清的細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h和6 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 高通量測(cè)序(二代測(cè)序) 使用試劑盒(QIAamp RNA kit，德國(guó)QIAGEN公司)提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄(Superscript Ⅲ First-Strand Synthesis System，美國(guó)Invitrogen公司)合成cDNA。取通過(guò)質(zhì)控檢測(cè)的樣本進(jìn)行下游的文庫(kù)構(gòu)建。cDNA經(jīng)純化后生成 Illumina’s Cluster Station上的Cluster，即可加入測(cè)序儀(HiSeq 2000，Illumina公司)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序過(guò)程中使用 Illumina’s sequencing control studio software version 2.8軟件，實(shí)時(shí)分析測(cè)序圖片，提取原始數(shù)據(jù)用于基本數(shù)據(jù)分析(Illumina’s real-time analysis version 1.8.70)。

1.2.3 測(cè)序結(jié)果分析 過(guò)濾數(shù)據(jù)，去除插入片段過(guò)長(zhǎng)的序列、低質(zhì)量序列、poly A序列和小片段序列，得到clean tags。將clean tags 和已知的小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)包括miRBase[13]、Rfam[14]、siRNA、piRNA、snoRNA等進(jìn)行比對(duì)。除Rfam使用cmsearch外[15]，其余都用Bowtie2軟件[16]對(duì)clean tag和小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。通過(guò)與已知的小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，鑒定出已知的siRNA。

統(tǒng)計(jì)siRNA的種類及數(shù)量，并對(duì)其做長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)。使用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的轉(zhuǎn)錄本數(shù)(transcripts per kilobase of exonmodel per million mapped reads，TPM)標(biāo)準(zhǔn)化小RNA的表達(dá)方式，參照Audic等[17]的差異基因檢測(cè)法，篩選兩樣本的差異表達(dá)基因。對(duì)差異檢驗(yàn)的P值進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，通過(guò)控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)決定P值的域值[18]。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 使用莖-環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)novel_sir3502和novel_sir2806的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)，引物為5′-CTCAACTGGT-GTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3′，使用反向引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。內(nèi)參：U6 F CTCGCTT-CGGCAGCACA; U6 R AACGCTTCACGAAT-TTGCGT。體系為5×SYBR Green qPCR Mix 4 μL、20×miRNA Primer F 1 μL、20×miRNA Primer R 1 μL、cDNA模板1 μL，ddH2O加至 20 μL。采用兩步法擴(kuò)增：95 ℃ 15 min；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s, 35個(gè)循環(huán)。通過(guò)2-ΔΔCT值計(jì)算病毒感染細(xì)胞與正常細(xì)胞之間siRNA表達(dá)量的變化。

2 結(jié)果

2.1 CVB3感染HeLa細(xì)胞后siRNA的總體出現(xiàn)差異

為了明確CVB3感染HeLa細(xì)胞3 h和6 h后，細(xì)胞中siRNA種類和表達(dá)水平的總體差異，我們分析比較了樣本的公共序列和特有序列。結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)3 h和6 h的對(duì)照細(xì)胞相比，CVB3感染HeLa細(xì)胞3 h和6 h后，siRNA增加數(shù)目分別為 1 846、1 154，降低數(shù)目分別為831和 1 009，表明siRNA 在CVB3感染HeLa細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用。病毒感染HeLa細(xì)胞6 h相對(duì)感染3 h的siRNA增加數(shù)目為978，降低數(shù)目為 1 662。表明CVB3感染后，細(xì)胞中各種siRNA表達(dá)量隨時(shí)間發(fā)生改變。

2.2 CVB3感染引起HeLa細(xì)胞中siRNA的改變

采用Bowtie比對(duì)軟件識(shí)別出已知的siRNA，濾除其中與已知高度同源的序列，以UNAFold二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊預(yù)測(cè)全新的siRNA序列。同時(shí)對(duì)siRNA的表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理，去掉在兩樣本歸一化后表達(dá)量log2 ratio<1 的siRNA。篩選與CVB3感染相關(guān)的siRNA，對(duì)測(cè)序樣本中全新siRNA 的表達(dá)進(jìn)行差異分析。相對(duì)正常細(xì)胞，病毒感染3 h、6 h后，HeLa細(xì)胞中發(fā)生變化的siRNA分別為14種和5種。

與正常細(xì)胞相比，病毒感染3 h的HeLa細(xì)胞中siRNA表達(dá)有變化的為novel_sir4680、novel_sir1648、novel_sir3502、novel_sir2806、novel_sir1897、novel_sir509、novel_sir1383、novel_sir1962、novel_sir2353、novel_sir4290、novel_sir2764、novel_sir3623、novel_sir1973和novel_sir2914，其中novel_sir2914表達(dá)下調(diào)，其余均升高(表1)。

表1 CVB3感染3 h后細(xì)胞中siRNA的表達(dá)變化

Tab.1 The change of siRNA after 3 h of CVB3 infection

siRNA idLog2 ratioRegulationnovel_sir46805.08746284Upnovel_sir16484.4429435Upnovel_sir35024.04439412Upnovel_sir28063.9248125Upnovel_sir18973.87651695Upnovel_sir5093.25738784Upnovel_sir13833.24792751Upnovel_sir19622.67807191Upnovel_sir23532.34146828Upnovel_sir42901.66337539Upnovel_sir27641.62803122Upnovel_sir36231.43888424Upnovel_sir19731.16528461Upnovel_sir2914-1.9558002Down

Log2 ratio：CVB3-HeLa_3h_RNA/HeLa RNA.

與正常細(xì)胞相比，病毒感染6 h后 HeLa細(xì)胞中siRNA表達(dá)發(fā)生變化的有novel_sir1399、novel_sir3502、novel_sir2806、novel_sir2627、novel_sir3115，其中novel_sir3115表達(dá)下調(diào)，其余均升高(表2)。

相對(duì)正常細(xì)胞，高通量測(cè)序結(jié)果顯示，在病毒感染3 h和6 h的 HeLa細(xì)胞中novel_sir3502和novel_sir2806均發(fā)生了改變(圖1)。

表2 CVB3感染6 h后細(xì)胞中siRNA的表達(dá)變化

Tab.2 The change of siRNA after 6 h of CVB3 infection

siRNA idLog2 ratioRegulationnovel_sir13993.594946589Upnovel_sir35023.448460501Upnovel_sir28063.426264755Upnovel_sir26272.906890596Upnovel_sir3125-1.825426495Down

Log2 ratio：CVB3-HeLa_6h_RNA/HeLa RNA.

圖1 CVB3感染3 h和6 h后 novel_sir3502、novel_sir2806的表達(dá)水平

Fig.1 The expression of novel_sir3502, novel_sir2806 after 3 h, 6 h of CVB3 infection

2.3 CVB3感染HeLa細(xì)胞引起novel_sir3502和novel_sir2806表達(dá)升高

為了進(jìn)一步驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果，我們對(duì)novel_sir3502和novel_sir2806兩種siRNA通過(guò)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行驗(yàn)證，熒光定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)CVB3感染HeLa細(xì)胞的確引起了兩種siRNA的升高，相對(duì)于正常HeLa細(xì)胞，CVB3感染HeLa細(xì)胞3 h和6 h后，novel_sir3502和novel_sir2806表達(dá)量的增長(zhǎng)倍數(shù)分別為1.6，1.52；1.77和1.65，均高于1.5倍(圖2)，雖然升高量稍微低于測(cè)序結(jié)果。結(jié)果表明CVB3感染HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)兩種新siRNA的升高。

n=3.

圖2 CVB3感染后3 h和6 h細(xì)胞中novel_sir3502、 novel_sir2806相對(duì)表達(dá)量

Fig.2 The relative expression of novel_sir3502, novel_sir2806 after 3 h, 6 h of CVB3 infection

2.4 novel_sir3502和novel_sir2806可識(shí)別核糖體前體RNA

為了解novel_sir3502和novel_sir2806調(diào)控細(xì)胞作用，將novel_sir3502和novel_sir2806通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這兩種siRNA與核糖體RNA序列均有同源序列，均識(shí)別45S核糖體前體RNA N1、N3、N4、N5和28S核糖體前體RNA N1、N2、N3、N4、N5。(圖3、圖4)。因此，CVB3感染誘導(dǎo)的兩種新siRNA可能在結(jié)合核糖體RNA后干擾核糖體成熟。

圖3 novel_sir3502通過(guò)NCBI進(jìn)行的序列比對(duì)

Fig.3 The sequence alignment of novel_sir3502 using BLAST

圖4 novel_sir2806通過(guò)NCBI進(jìn)行的序列比對(duì)

Fig.4 The sequence alignment of novel_sir2806 using BLAST

3 討論

內(nèi)源性siRNA在基因調(diào)控通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們來(lái)源于雙鏈固有轉(zhuǎn)錄物，引導(dǎo)AGO效應(yīng)蛋白互補(bǔ)性靶向核酸[19-20]。Dicer屬于核糖核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ)家族，能夠裂解病毒的dsRNA分子，產(chǎn)生20～24 nt長(zhǎng)的vsiRNA分子。隨后，vsiRNA被RISC中AGO家族蛋白識(shí)別。在RISC中，只有1條被稱為導(dǎo)向鏈的保留下來(lái)，以針對(duì)病毒基因組中的互補(bǔ)序列。目標(biāo)序列與siRNA完美互補(bǔ)，導(dǎo)致病毒基因組由AGO切割。在秀麗隱桿線蟲(chóng)中，內(nèi)源性siRNA參與基因組保護(hù)和基因調(diào)控[21]。果蠅黑腹內(nèi)siRNA在特定的Dicer和Argonaute蛋白家族成員幫助下產(chǎn)生，在轉(zhuǎn)座子控制和病毒感染保護(hù)中起重要作用[22]。脊椎動(dòng)物內(nèi)siRNA的生物學(xué)功能包括抑制轉(zhuǎn)座因子、阻止染色質(zhì)組成及在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因[6, 19, 23]。

與其他小RNA相比，對(duì)內(nèi)源性siRNA的研究還不夠深入。內(nèi)源性siRNA來(lái)源于由Dicer切割處理的完全互補(bǔ)的內(nèi)源性RNA前體[24]。由此產(chǎn)生的siRNA與一種特定的前體蛋白結(jié)合，最終確定了復(fù)合物的生物學(xué)影響。內(nèi)源性siRNA的合成機(jī)制以及生物學(xué)作用顯示出物種特異性差異。內(nèi)源性siRNA可抑制轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，影響特定基因位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄和染色體結(jié)構(gòu)。因此，內(nèi)源性siRNA通過(guò)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)，在許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如保護(hù)外來(lái)病原體、抑制轉(zhuǎn)座因子和染色質(zhì)組成[19, 25]。

目前，對(duì)于siRNA調(diào)控基因表達(dá)的研究還在不斷摸索中，其調(diào)控模型也在不斷完善。同時(shí)，小分子RNA的研究也存在很多問(wèn)題，雖然小分子RNA的種類在增加，但其功能并不是十分清楚。RNA干擾技術(shù)已被迅速而廣泛地應(yīng)用到基因功能、基因表達(dá)調(diào)控等熱門(mén)研究領(lǐng)域，但在應(yīng)用方面仍存在著許多疑難問(wèn)題[26-27]。

本研究發(fā)現(xiàn)CVB3感染細(xì)胞后，siRNA的表達(dá)出現(xiàn)變化。將持續(xù)表達(dá)的novel_sir3502、 novel_sir2806與核糖體前體RNA進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示存在互補(bǔ)位點(diǎn)，可以識(shí)別45S核糖體前體RNA N1、N3、N4、N5和28S核糖體前體RNA N1、N2、N3、N4、N5。真核細(xì)胞核糖體的大小亞基是在核中形成的，在核仁部位rDNA經(jīng)RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄出45S rRNA(纖維部的纖維狀物質(zhì))，是rRNA的前體分子，與胞質(zhì)運(yùn)來(lái)的蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNP復(fù)合體。45S rRNA甲基化后，經(jīng)RNA酶裂解為2個(gè)分子：18S rRNA和32S rRNA；后者再裂解為28S rRNA和5.8S rRNA。成熟的rRNA僅為45S rRNA的一半，因此，這兩種內(nèi)源性siRNA可能對(duì)于HeLa細(xì)胞的核糖體成熟具有一定的作用，提示CVB3感染可能干擾核糖體成熟。本文對(duì)siRNA的研究，時(shí)間周期較短，未對(duì)CVB3感染后siRNA發(fā)生變化的機(jī)制及對(duì)細(xì)胞或病毒復(fù)制的影響做進(jìn)一步的探討研究。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們將采用MOI=1的病毒感染細(xì)胞，觀察感染6 h、12 h等多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的siRNA變化，探討siRNA隨著感染時(shí)間不同而產(chǎn)生的變化，并進(jìn)一步研究CVB3感染對(duì)siRNA表達(dá)的影響及其作用機(jī)制和是否通過(guò)siRNA影響病毒復(fù)制等。