姚夢(mèng)依，錢(qián)嘉寧，狄玉昌，陳潤(rùn)，白嘉誠(chéng)，張雪蓮

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200433

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)目前仍是全世界十大致死的致病感染源之一，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO) 2018年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，僅2017年度全球共發(fā)生約 1 000 萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病病例及160萬(wàn)死亡病例[1]，有55.8萬(wàn)新發(fā)病例對(duì)抗結(jié)核一線藥物——利福平耐受，其中有82%的患者感染的是耐多藥結(jié)核菌。耐多藥、廣泛耐藥菌的產(chǎn)生使得結(jié)核病治療面臨巨大挑戰(zhàn)[2-3]，目前臨床上廣泛使用的仍為20世紀(jì)研發(fā)的藥物。近幾十年來(lái)抗結(jié)核上市新藥僅有貝達(dá)喹啉和德拉馬尼，但耐藥結(jié)核菌的不斷產(chǎn)生，使得抗結(jié)核新藥的研發(fā)依然迫在眉睫[4-5]。

ATB-152E和ATB-152J為本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的具有良好抗結(jié)核活性的2種結(jié)構(gòu)類(lèi)似的小分子化合物，最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)均為0.09 μg/mL，專(zhuān)利ZL201210088290.0。由于結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株中存在的突變基因往往與該藥物的作用靶標(biāo)密切相關(guān)[6-7]，為探索ATB-152E和ATB-152J的抗結(jié)核靶標(biāo)及可能的耐藥機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)篩選了這2種小分子化合物的耐藥菌株，并對(duì)其進(jìn)行表型分析，期望為后續(xù)全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)耐藥菌基因組突變及探明ATB-152E和ATB-152J可能的抑菌作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 結(jié)核分枝桿菌H37Ra(MycobacteriumtuberculosisH37Ra，簡(jiǎn)寫(xiě)為WT Ra)為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種，卷曲霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 油酸、白蛋白、右旋葡萄糖、過(guò)氧化氫酶(oleic acid，albumin，dextrose，catalase，OADC)培養(yǎng)基100 mL：稱(chēng)取5 g 牛血清白蛋白第5組分(上海艾研生物科技有限公司)、0.03 g 過(guò)氧化氫酶(美國(guó)Sigma公司)、2 g 右旋葡萄糖、0.85 g NaCl、12 μL Oleic Acid(上海生工生物工程有限公司)，加水定容至100 mL，用0.22 μm濾膜(德國(guó)默克公司)過(guò)濾除菌； Sauton培養(yǎng)基100 mL：稱(chēng)取0.4 g天門(mén)冬素、0.2 g檸檬酸、0.05 g磷酸氫二鉀、0.05 g MgSO4·7H2O、0.05 g枸櫞酸鐵銨、6 mL甘油，氨水調(diào)pH至7.2～7.4，加水定容至100 mL；米氏7H9、7H10 肉湯為美國(guó) BD公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 宏觀變倍體視顯微鏡(型號(hào)：Stereo Discovery. V20)購(gòu)自德國(guó)卡爾蔡司公司。

1.1.4 抗結(jié)核活性小分子化合物 ATB-152E和ATB-152J為上海皓元化學(xué)合成有限公司為本實(shí)驗(yàn)室合成定制[8]。

1.2 方法

1.2.1 耐藥菌的篩選 準(zhǔn)備含有1x、2x、4x、8x MIC ATB152-E和ATB152-J的7H10-OADC平板。將對(duì)數(shù)期的WT Ra按1∶50接種于100 mL 7H9-OADC培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2周至A600=0.8，按每管1 mL(約107CFU/mL)菌液分裝，13 000 r/min離心1 min，棄去900 μL上清液，將菌體重懸在100 μL的培養(yǎng)基中備用。將上述離心、重懸、含107CFU/mL的菌液，分別涂布于含有不同濃度的ATB152-E或者ATB152-J的7H10-OADC平板(1x MIC ATB152-J、2x MIC ATB152-E、2x MIC ATB152-J、4x MIC ATB152-E、4x MIC ATB152-J)，每個(gè)梯度設(shè)多個(gè)重復(fù)板。將這些平板于37 ℃倒置培養(yǎng)3～4周，統(tǒng)計(jì)每個(gè)濃度梯度生長(zhǎng)的菌落數(shù)，挑取單克隆，在液體培養(yǎng)基7H9-OADC中37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加有單克隆生長(zhǎng)平板對(duì)應(yīng)的藥物濃度。待菌長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，將菌液繼續(xù)在含有2倍化合物濃度的固體平板上劃線培養(yǎng)。如此不斷提高化合物篩選濃度以獲得遺傳穩(wěn)定的耐藥菌株。

1.2.2 耐藥菌MIC的測(cè)定 Mtb MIC測(cè)定方法采用微孔法[9]，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的WT Ra和耐藥菌菌液分別稀釋到A600=0.1，然后用7H9-OADC培養(yǎng)基稀釋100倍。取2塊96孔圓底微孔板，在第1塊板中，B2、D2孔中加入198 μL 稀釋后的耐藥菌菌液，B、C、D、E行的其余孔內(nèi)加入100 μL耐藥菌菌液，在F2和G2孔內(nèi)加入稀釋后的WT Ra菌液，F(xiàn)、G行的其余孔加入100 μL WT Ra菌液；在B2和D2孔內(nèi)加入2 μL濃度為10 mg/mL的ATB152-E(或ATB152-J)，F(xiàn)2和G2孔內(nèi)加入2 μL濃度為10 mg/mL的卷曲霉素作為陽(yáng)性對(duì)照；在B2孔內(nèi)吸取100 μL混勻的菌液加入B3孔內(nèi)，吹打均勻后再吸取100 μL加至B4孔。以此類(lèi)推，梯度稀釋?zhuān)钡较乱恍蠧10孔，直接吸取100 μL棄去，C11孔為不加化合物的對(duì)照孔；D、E行是技術(shù)重復(fù)孔，方法相同。F2～F10同理梯度稀釋?zhuān)珿行同理為技術(shù)重復(fù)孔。在第2塊板中，第2列B～E內(nèi)，加入稀釋后的WT Ra菌液198 μL和2 μL濃度為144 μg/mL的化合物(終濃度為16x MIC)，B2、C2中加ATB152-E，D2、E2中加ATB152-J；接下來(lái)每行進(jìn)行同上的梯度稀釋?zhuān)蛔詈竺繅K板的四周每孔需加上200 μL無(wú)菌H2O，以防蒸發(fā)。封口膜封口，37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，3周后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 耐藥菌菌落形態(tài)觀察 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的WT Ra和耐藥菌菌液分別稀釋到A600=0.3，梯度稀釋到10-4，取50 μL涂布于相應(yīng)MIC的平板，37 ℃ 倒置培養(yǎng)約6周，置于宏觀變倍體視顯微鏡下觀察菌落形態(tài)并拍照記錄，對(duì)菌落形態(tài)表型進(jìn)行分析。

1.2.4 耐藥菌的成膜觀察 收集5 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的WT Ra和耐藥菌菌液，用Sauton培養(yǎng)基洗1次； 用Sauton培養(yǎng)基將菌液調(diào)整到A600=0.3，再稀釋30倍，于24孔板中加入菌液1.3 mL/孔，每種菌各3個(gè)復(fù)孔，四周加1 mL無(wú)菌H2O以防蒸發(fā)；封口膜封口，鋁箔包裹，于37 ℃培養(yǎng)4～6周，觀察結(jié)果并對(duì)形成的生物膜表型進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 耐藥菌的篩選

經(jīng)過(guò)含藥平板涂板以及平板劃線逐步提高化合物濃度的層層篩選，得到了ATB-152E的耐藥株(表1)以及ATB-152J的耐藥株(表2)。第1輪篩選從1x MIC ATB-152E平板篩選到1株耐藥菌，其余重復(fù)平板上的單克隆沒(méi)能在含有化合物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，即未能形成穩(wěn)定耐藥；從6個(gè)不同的2x MIC ATB-152E平板篩選到6株耐藥菌；后期通過(guò)不斷提高化合物篩選濃度的方法，最終篩選到ATB-152E耐藥菌17株(表1)。ATB-152J耐藥菌也經(jīng)歷類(lèi)似的篩選過(guò)程，在4x MIC和8x MIC分別篩選到1個(gè)生長(zhǎng)菌落，通過(guò)連續(xù)不斷提高化合物濃度，最終篩選到ATB-152J耐藥菌15株(表2)。這兩種化合物的耐藥頻率均為10-7，即涂107CFU于平板上最多只能長(zhǎng)出1個(gè)耐藥菌株。

2.2 耐藥菌MIC測(cè)定

為確定篩選得到的耐藥菌遺傳穩(wěn)定性及具體耐藥程度，對(duì)篩選的菌株進(jìn)行兩種化合物的MIC測(cè)定。采用微孔法對(duì)在含4x MIC以上的培養(yǎng)板上依然生長(zhǎng)的耐藥菌進(jìn)行MIC測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3所示。測(cè)定結(jié)果顯示這些耐藥菌分別為化合物ATB-152E和ATB-152J的耐藥菌株，且部分菌屬于高度耐藥菌，它們是：4 MICE_2、8 MICE_10、4 MICJ_1、8 MICJ_1、8 MICJ_2、8 MICJ_4、8 MICJ_5和8 MICJ_6。

2.3 耐藥菌與野生株菌落形態(tài)的差異

為分析篩選的耐藥菌與野生株的形態(tài)差異， 用宏觀變倍體視顯微鏡觀察7H10-OADC固體平板上培養(yǎng) 6 周后的單菌落形態(tài)。結(jié)果顯示，生長(zhǎng)6周后，耐藥菌的形態(tài)與野生株存在顯著差異。隨著耐藥程度的增加，ATB-152E耐藥菌形態(tài)逐漸變得更為隆起，褶皺變多；最高倍的耐藥菌褶皺密集，幾乎凝結(jié)成團(tuán)塊狀。此外ATB-152E耐藥菌較野生株更為干燥(圖1)。ATB-152J耐藥菌隨著耐藥程度的增加，形態(tài)更為扁平，褶皺減少，表面呈現(xiàn)出顆粒狀隆起(圖1)。

表1 ATB-152E H37Ra耐藥菌

Tab.1 ATB-152E resistant H37Ra strains

ATB-152Er H37Ra strainsSource1MICE_1colony from 1x MIC plate2MICE_1colony from 2x MIC plate2MICE_2colony from 2x MIC plate2MICE_3colony from 2x MIC plate2MICE_5colony from 2x MIC plate2MICE_6colony from 2x MIC plate2MICE_7colony from 2x MIC plate4MICE_3.1restreaked from 2MICE_34MICE_5.1resreaked from 2MICE_54MICE_5.2resreaked from 2MICE_54MICE_2resreaked from 2MICE_28MICE_10resreaked from 4MICE_24MICE_1'colony from 4x MIC plate4MICE_2'colony from 4x MIC plate8MICE_2.2'resreaked from 4MICE_2'8MICE_2.3'resreaked from 4MICE_2'8MICE_2.4'resreaked from 4MICE_2'

表2 ATB-152J H37Ra耐藥菌

Tab.2 ATB-152J resistant H37Ra strains

ATB-152Jr H37Ra strainsSource4MICJ_1colony from 4x MIC plate4MICJ_3colony from 4x MIC plate4MICJ_1'colony from 4x MIC plate4MICJ_2'colony from 4x MIC plate4MICJ_3'colony from 4x MIC plate4MICJ_4'colony from 4x MIC plate8MICJ_1.1'resreaked from 4MICJ_1'8MICJ_1.2'resreaked from 4MICJ_1'8MICJ_1.3'resreaked from 4MICJ_1'8MICJ_1.4'resreaked from 4MICJ_1'8MICJ_1colony from 8x MIC plate8MICJ_2colony from 4x MIC plate8MICJ_4colony from 4x MIC plate8MICJ_5colony from 4x MIC plate8MICJ_6colony from 4x MIC plate

表3 耐藥菌MIC測(cè)定

Tab.3 MICs against monodrug-resistant H37Ra strains

H37Ra strainMIC(μg/mL)CompoundWT0.09ATB-152E or ATB-152J 4MICE_3.112.5ATB-152E4MICE_5.112.5ATB-152E4MICE_5.212.5ATB-152E4MICE_250ATB-152E8MICE_1025ATB-152E4MICJ_16.25ATB-152J4MICJ_33ATB-152J8MICJ_125ATB-152J8MICJ_225ATB-152J8MICJ_425ATB-152J8MICJ_525ATB-152J8MICJ_625ATB-152J

2.4 耐藥菌與野生株成膜能力的差異

研究中還發(fā)現(xiàn)耐藥菌菌膜形成速度以及形成時(shí)間與野生株也存在明顯差異，因此我們對(duì)耐藥菌株的生長(zhǎng)表型進(jìn)行了分析。H37Ra野生株(WT)、 ATB-152E高度耐藥菌株4MICE_2、8MICE_10、 ATB-152J高度耐藥菌株4MICJ_1、8MICJ_1在液體Sauton培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6周后，液體表面會(huì)逐漸形成生物膜。將生物膜置于宏觀變倍體視顯微鏡下觀察(圖2)，結(jié)果顯示，4周時(shí)菌株4MICE_2沒(méi)有形成生物膜，4MICJ_1生物膜并沒(méi)有完全形成，而野生株生物膜已基本形成，菌株8MICE_10和8MICJ_1生物膜形成能力都強(qiáng)于野生株，且8MICJ_1成膜能力更強(qiáng)；6周時(shí)4MICE_2生物膜仍未形成，4MICJ_1生物膜已形成，但膜的完整性明顯低于野生株，8MICE_10和8MICJ_1生物膜形成能力都強(qiáng)于野生株，均有褶皺形成，且8MICJ_1成膜能力更強(qiáng)，褶皺更多。

圖1 H37Ra野生株、ATB-152E耐藥株和ATB-152J耐藥株的菌落形態(tài)

Fig.1 Colony morphology of H37Ra (WT), ATB-152E resistant H37Ra strain and ATB-152J resistant H37Ra strain

圖2 H37Ra野生株、ATB-152E耐藥株和ATB-152J耐藥株的生物膜形成

Fig.2 Biofilm formation of H37Ra (WT), ATB-152E resistant H37Ra strain and ATB-152J resistant H37Ra strain

3 討論

細(xì)菌產(chǎn)生耐藥有各種各樣的機(jī)制，研究表明目前主要包括通過(guò)降低細(xì)胞膜的通透性以減少藥物與靶標(biāo)的結(jié)合、靶標(biāo)發(fā)生基因突變、細(xì)菌對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行翻譯后修飾、對(duì)抗菌藥物進(jìn)行修飾等[10]。在Mtb中，細(xì)菌耐藥與靶標(biāo)基因突變關(guān)系密切，如果基因組不發(fā)生變化，則為表型耐藥，細(xì)菌轉(zhuǎn)接后無(wú)法在含藥培養(yǎng)基中生長(zhǎng)[11]，具有遺傳穩(wěn)定性的耐藥則大多由基因組上靶蛋白的突變導(dǎo)致，因而篩選細(xì)菌的耐藥菌，探究耐藥菌中的突變位點(diǎn)，是尋找抗結(jié)核藥物中作用靶標(biāo)最保守、最可靠的方式[6-7]。

本研究篩選了ATB-152E和ATB-152J兩種化合物的耐藥菌，在篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，兩種化合物的耐藥菌都比較難以篩選，只有當(dāng)平板上涂布菌量達(dá)到107以上才能長(zhǎng)出1株耐藥菌株，且耐藥頻率較低。研究中發(fā)現(xiàn)，Mtb ATB-152E和ATB-152J耐藥菌菌落形態(tài)和生物膜生長(zhǎng)速度和成熟均與野生株存在顯著的差異。在篩選過(guò)程中耐藥菌的菌落形態(tài)以及液體培養(yǎng)菌膜的產(chǎn)生都發(fā)生很大變化，菌落形態(tài)明顯比野生株更為隆起。液態(tài)培養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)較長(zhǎng)時(shí)間的Mtb 會(huì)形成完整的菌膜，菌膜的生長(zhǎng)速度和成熟與細(xì)菌代謝和毒力密切相關(guān)[12]。本研究中耐藥菌菌膜形成速度也與野生株存在明顯差異，在同一接種量、相同生長(zhǎng)時(shí)間條件下，有的耐藥菌較野生株菌膜更為厚實(shí)，有的則未能形成完整菌膜，因此對(duì)耐藥菌株的生長(zhǎng)表型進(jìn)行了分析。

盡管ATB-152E和ATB-152J的結(jié)構(gòu)較為類(lèi)似，但耐藥菌株的表型卻并不完全一致，提示兩種化合物的突變位點(diǎn)可能并不完全相同或化合物作用存在多個(gè)作用靶點(diǎn)。Mtb的細(xì)胞壁脂質(zhì)含量高達(dá)約40%的細(xì)胞干重[13]，且細(xì)菌的菌落形態(tài)、生物膜的形成均與細(xì)菌細(xì)胞壁的脂質(zhì)成分相關(guān)[14]，因而這些表型的改變證明活性化合物耐藥菌的基因突變可能導(dǎo)致細(xì)菌脂肪酸合成異常。此外ATB-152E或ATB-152J作用Mtb的 RNA-seq數(shù)據(jù)分析(未發(fā)表數(shù)據(jù))也初步發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成通路相關(guān)基因有顯著變化，提示兩種化合物的作用機(jī)制可能與脂肪酸合成密切相關(guān)。脂肪酸合成是結(jié)核分枝菌酸(mycolic acid，MA)合成的重要通路，而MA是Mtb細(xì)胞壁的重要組分，因此脂肪酸合成通路是抗結(jié)核新藥開(kāi)發(fā)非常有潛力的作用靶點(diǎn)方向[15-16]。異煙肼的作用靶點(diǎn)InhA就是靶向脂肪酸合成通路FAS-Ⅱ系統(tǒng)[17]。臨床前階段的抗結(jié)核藥物BM212也是靶向該通路上的MmpL3，通過(guò)阻斷海藻糖單霉菌酸酯(trehalose monomycolates，TMM)的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響分枝酸的合成[18]?？菇Y(jié)核新藥德拉馬尼也被認(rèn)為影響了MA的合成，可見(jiàn)脂肪酸合成對(duì)于Mtb非常重要，通路中的關(guān)鍵蛋白都有可能會(huì)成為藥物作用的靶點(diǎn)[13]。

隨著微生物全基因組測(cè)序技術(shù)在Mtb耐藥機(jī)制研究中趨于成熟[19]，基于本研究ATB-152E和ATB-152J耐藥菌的獲得，后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)這些耐藥菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，從比較基因組角度來(lái)尋找引起菌株耐受兩種化合物以及引起耐藥菌株表型發(fā)生顯著變化的分子機(jī)制。一方面從突變基因的生化角度，體外表達(dá)純化相關(guān)基因編碼蛋白，利用藥物親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性(drug affinity responsive target stability，DARTS)技術(shù)、等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry，ITC) 測(cè)定目標(biāo)蛋白與活性化合物的結(jié)合能力，同時(shí)檢測(cè)化合物對(duì)這些基因的體外生化功能的影響；另一方面從Mtb內(nèi)作用的靶標(biāo)角度，通過(guò)菌體內(nèi)過(guò)表達(dá)篩選的突變基因，評(píng)價(jià)過(guò)表達(dá)菌株對(duì)ATB-152E和ATB-152J化合物的敏感性，確定基因與耐藥的關(guān)系，進(jìn)而最終闡明化合物的耐藥和作用機(jī)制。