秦紹釗 張柱亭 王 洪 李御企

（凱里學(xué)院，貴州 凱里 556011）

油茶（Camellia oleifera）作為世界四大木本油料作物之一，屬山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia），是中國(guó)特有的木本油料作物[1]。炭疽菌屬（Colletotrichum Corda）可以為害油茶、蘋果等190 種以上的植物，是重要的植物病原真菌[2]。油茶炭疽病主要為害油茶的花、葉、果實(shí)及枝梢，嚴(yán)重時(shí)能引起落果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株死亡，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[3～4]。在油茶炭疽病發(fā)病的典型區(qū)域，由炭疽病引起的落蕾達(dá)到26%～45%，晚期病果雖然可以采收，但種子含油量不高，約為健康油茶種子的1/2，有的甚至更低[5]。

2019 年上半年貴州已完成油茶新造面積12806.67hm2，低改面積14513.33hm2。近年來，隨著油茶種植面積的擴(kuò)大和良種使用率的提高，貴州油茶的病害問題日趨嚴(yán)重。多年的林間觀測(cè)結(jié)果表明，為害貴州油茶病害的主要病征多為黑褐色病斑，常造成落葉，致使油茶樹減產(chǎn)，甚至死亡，給油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了巨大經(jīng)濟(jì)和生態(tài)損失[6]。帥小春等，2019 年報(bào)道的多基因鑒定方法不利于基層檢測(cè)工作開展[7]。

本研究所構(gòu)建最大簡(jiǎn)約法（MP）和最大似然法（ML）2 種系統(tǒng)發(fā)育樹取得一致結(jié)果，檢測(cè)方法更加簡(jiǎn)捷、有效，有利于與基礎(chǔ)研究工作的快速開展。本研究通過形態(tài)及分子鑒定等方法系統(tǒng)鑒定引起貴州油茶炭疽病種類，旨在為當(dāng)?shù)乜共》N質(zhì)的選育及油茶病害防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2017～2018 年期間，對(duì)黔東南州黎平縣、錦屏縣及黃平縣；銅仁市玉屏縣、石阡縣及松桃縣油茶種植區(qū)病害情況進(jìn)行了詳細(xì)調(diào)查統(tǒng)計(jì)。根據(jù)其病征（如圖1），從貴州省油茶示范園區(qū)內(nèi)采集典型炭疽病病葉，帶回實(shí)驗(yàn)室，PDA 培養(yǎng)3d，4℃保存，進(jìn)行病原菌分離檢測(cè)。

圖1 A 和B 分別油茶炭疽病病葉的正反面

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化。常規(guī)組織分離法：先用75%的酒精處理病健交界的組織，0.1%升汞溶液消毒，無菌水漂洗干凈，PDA 培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的形態(tài)鑒定。取5mm 菌餅，在PDA 平板28℃黑暗12h 培養(yǎng)，2～5d 連續(xù)觀察菌落的形態(tài)、顏色。取10μL 分生孢子懸浮液在光學(xué)顯微鏡下觀察記錄其大小及形態(tài)特征。

1.2.3 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析。取20 mg 菌絲經(jīng)液氮研磨，樣品DNA 提取用生工生物工程（上海）股份有限公司的試劑盒，Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒SK8259。擴(kuò)增引物 如 下：ITS15’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’，ITS45’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’。將測(cè)序 rDNA-TS1 和 rDNA-TUB2 序列與GenBank 中相關(guān)序列分別用ClustalX1.83軟件進(jìn)行比對(duì)分析。選出與各分離菌株相似度較高的相應(yīng)序列，采用MEGA7.0.14 軟件中的最大簡(jiǎn)約法（MP）和最大似然法（ML）做聚類分析，把所有的堿基狀態(tài)處理為無序，并給以相同的權(quán)重。自舉檢驗(yàn)重復(fù)1000 次以獲得各分支的支持率，構(gòu)建鄰近法（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌菌落與形態(tài)特征

代表菌株KLXY-15-1 在 標(biāo)準(zhǔn)PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7d，菌落直徑為85～95mm，菌落邊緣整齊，中間散布深灰色輻射狀色素，邊緣為灰白色，氣生菌絲濃密棉絮狀（如圖2），菌落背面散布不規(guī)則、輻射狀的黑色沉積（圖3）。

圖2 KLXY-15-1 培養(yǎng)基上的菌落

圖3 KLXY-15-1 的分生孢子

分生孢子形成在菌絲基部，大小為（14.8～19.5）μm×（5.0～5.8）μm，直圓筒狀，通常稍向基部逐漸變細(xì)（如圖3），這些特征與卡哈瓦炭疽菌（C.kahawae）特征一致。

2.2 分子鑒定

本研究6 個(gè)分離菌DNA 為模板，對(duì)其核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和微管蛋白（TUB2）基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序。NCBI Blastn 比對(duì)后確定6 個(gè)菌株同屬于炭疽菌屬卡哈瓦炭疽菌，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。代表菌株KLXY-15-1 的ITS 基因序列與其它同屬菌株序列經(jīng)最大簡(jiǎn)約法（MP）和最大似然法（ML）共同構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，KLXY-15-1 序列與卡哈瓦炭疽菌（C.kahawae）菌株MG717320.1 聚類結(jié)果一致，聚為一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支，能與同屬其它菌株明顯區(qū)分開。因此，根據(jù)分離所得鑒定結(jié)果將KLXY-15-1 等6 個(gè)菌株鑒定為Colletotrichum kahawae。

3 結(jié)論與討論

本研究所利用的最大簡(jiǎn)約法（MP）中和最大似然法（ML）聚類分析結(jié)果一致，KLXY-15-1 炭疽菌形成2 個(gè)大的聚類群，表明試驗(yàn)鑒定結(jié)果真實(shí)有效，能夠在卡哈瓦炭疽菌快捷、高效的基礎(chǔ)研究鑒定工作中提供理論基礎(chǔ)。

近幾年，油茶是貴州省重點(diǎn)打造的特色產(chǎn)業(yè)之一，現(xiàn)培育有“黔金果”“三山谷”“梵真坊”等26 個(gè)油茶品牌。在貴州以擴(kuò)大油茶基地規(guī)模、提高低產(chǎn)林質(zhì)量、提升油茶精深加工水平為重點(diǎn)，帶動(dòng)油茶產(chǎn)業(yè)的高速持續(xù)發(fā)展過程中，病害對(duì)產(chǎn)業(yè)的危害程度日益加重，病原物的鑒定方法需要進(jìn)一步總結(jié)與規(guī)范，多基因的系統(tǒng)遺傳學(xué)能夠提供較準(zhǔn)確和可信的結(jié)果，并能夠真正的解決分類鑒定上存在的問題。