吳俊林 郭傳濱 賈真 郝浩浩 許曉敬 楊立均 孫會忠

摘要?采用火焰分光光度法對從煙草根際土壤中分離到細(xì)菌ZMD02的解鉀活性進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，在28?℃、180?r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)7?d后，菌株ZMD02發(fā)酵液中水溶性速效鉀含量達(dá)1.5?μg/mL，故將ZMD02定性為硅酸鹽菌株。對ZMD02的生長特性研究表明，ZMD02對不同糖源的發(fā)酵產(chǎn)氣能力表現(xiàn)為葡萄糖>麥芽糖>乳糖>直鏈淀粉>支鏈淀粉;對碳同化能力表現(xiàn)為麥芽糖>葡萄糖>乳糖>直鏈淀粉>支鏈淀粉;ZMD02對不同氮源的同化能力表現(xiàn)為酵母膏>蛋白胨>硫酸銨>硝酸鉀>尿素;ZMD02的最適生長溫度為30?℃，最適pH為7。ZMD02菌株可作為煙草生物鉀肥開發(fā)的備用菌株。

關(guān)鍵詞?煙草;解鉀菌;生長特性

中圖分類號?S572文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A文章編號?0517-6611（2020）07-0170-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.048

Potassium?Dissolving?Activity?and?Growth?Characteristics?of?Silicate?Bacteria?ZMD02

WU?Junlin，GUO?Chuanbin，JIA?Zhen?et?al

（Zhumadian?Branch?of?Henan?Provincial?Tobacco?Company，Zhumadian，?Henan?463000）

Abstract?The?potassium?activity?of?bacteria?ZMD02?isolated?from?tobacco?rhizosphere?soil?was?determined?by?flame?spectrophotometry.?The?results?showed?that?after?7?days?of?fermentation?at?28?℃?and?180?r/min，?the?content?of?watersoluble?rapidly?available?potassium?in?ZMD02?fermentation?broth?reached?1.5?μg/mL.?Therefore，?ZMD02?was?characterized?as?silicate?strain.?The?growth?characteristics?of?ZMD02?showed?that?the?order?of?fermentation?capacity?of?ZMD02?to?different?sugar?sources?was?glucose?>?maltose?>?lactose?>?amylose?>?amylose.?The?order?of?carbon?assimilation?ability?was?maltose?>?glucose?>?lactose?>?amylose?>?amylose.?The?order?of?assimilation?ability?of?ZMD02?to?different?nitrogen?sources?was?yeast?extract?>?peptone?>?ammonium?sulfate?>?nitrate?>?urea.?The?optimum?growth?temperature?of?ZMD02?was?30?℃?and?the?optimum?pH?was?7.?ZMD02?strain?could?be?used?as?an?alternative?strain?for?the?development?of?biopotash?fertilizer?in?tobacco.

Key?words?Tobacco;Silicate?bacteria;Growth?characteristics

基金項目?河南省煙草公司駐馬店市公司項目“植煙土壤的微生物定向調(diào)控保育技術(shù)研究”;河南省高等學(xué)校重點科研項目（16A180003）。

作者簡介?吳俊林（1986—），男，河南駐馬店人，助理農(nóng)藝師，從事煙葉生產(chǎn)與管理研究。

收稿日期?2019-10-02

鉀不是生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)成分，但鉀素具有維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、保持細(xì)胞的滲透壓、吸收養(yǎng)分和構(gòu)成酶的輔酶等生理功能，由于鉀易被植物秸稈、果實、籽粒等形式帶走，土壤作為一個天然鉀庫，90%～98%的鉀存在于硅酸鹽礦物質(zhì)中，植物并不能直接吸收利用[1-3]。因此，必須不斷補充鉀才能滿足植物生長發(fā)育的需要，尤其對于嗜鉀作物煙草而言，補充鉀素顯得尤為重要[4-6]。解鉀菌（silicate?bacterium）是一類可以分解硅酸鹽礦物的細(xì)菌，也稱為硅酸鹽細(xì)菌，它能夠使礦物中的鉀分解為植物科吸收利用的有效鉀[7-9]。隨著煙草有機（綠色）生產(chǎn)發(fā)展理念的提倡和推廣，生物鉀肥在煙草產(chǎn)量提高和品質(zhì)改善方面的作用越來越受到重視，在此大背景下，分離篩選野生解鉀菌菌種資源具有極強的理論價值和應(yīng)用潛力。筆者從煙草根際土壤分離到一株細(xì)菌，編號為ZMD02，對其解鉀活性及其生長特性進(jìn)行研究，以期為該菌株的誘變育種、生物鉀肥開發(fā)等下游研究奠定理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

解鉀菌ZMD02：分離于煙草的根際土壤，保存于駐馬店市煙草公司生產(chǎn)技術(shù)中心實驗室。

解鉀菌發(fā)酵培養(yǎng)基：按100?g培養(yǎng)基計，分別含有鉀長石0.30?g（超純水水洗5次），磷酸氫二鈉0.20?g，碳酸鈣0.01?g，七水硫酸鎂0.5?mg，三氯化鐵0.5?mg，蔗糖0.50?g，海藻糖0.10?g，瓊脂粉1.80?g，pH控制在7.0～7.5。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖6.00?g，硫酸鎂0.30?g，硫酸銨0.20?g，氯化鈉5.00?g，瓊脂粉18.00?g，蒸餾水1?L，pH?7.0。

斜面培養(yǎng)基：采用LB培養(yǎng)基[10]。

1.2?方法

1.2.1?菌株產(chǎn)鉀能力測定。

目標(biāo)菌株在LB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)后，取OD600=0.2的菌液按2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)置不接種的空白對照，在28?℃、160?r/min條件下培養(yǎng)7?d。每24?h取樣一次，于4?℃、1?000?r/min離心10?min，采用火焰分光光度計測定離心后上清液中水溶性速效鉀含量[2，11]。3次重復(fù)取平均值，下同。

1.2.2?菌株生長特性測定。

糖發(fā)酵能力：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別選取葡萄糖、支鏈淀粉、直鏈淀粉、麥芽糖和乳糖作為糖源配制培養(yǎng)基，按2%接種量（OD600?=?2，下同）接入待測菌株，在28?℃培養(yǎng)48?h，觀察杜氏管內(nèi)氣體高度。

碳同化能力：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別選取葡萄糖、支鏈淀粉、直鏈淀粉、麥芽糖和乳糖作為碳源配制培養(yǎng)基，按2%接種量接入待測菌株，培養(yǎng)28?℃培養(yǎng)72?h，用分光光度計測定菌體OD600。

氮同化能力：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別選取硫酸銨、硝酸鉀、尿素、酵母膏和蛋白胨作為氮源，按2%接種量接入目標(biāo)菌株，28?℃培養(yǎng)72?h，用分光光度計測定菌體OD600。

生長溫度：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別按2%接種量接入待測菌株，分別置于16、20、24、28、32、36、40?℃條件下培養(yǎng)72?h，用分光光度計測定菌體OD600。

生長pH：分別將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH調(diào)整為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按2%接種量接入待測菌株，28?℃培養(yǎng)72?h，用分光光度計測定菌體OD600。

2?結(jié)果與分析

2.1?菌株ZMD02的解鉀能力

經(jīng)過7?d連續(xù)發(fā)酵，菌株ZMD02發(fā)酵上清液中，速效鉀含量存在變化，發(fā)酵液中的速效鉀含量從第3天開始迅速增加，第6天達(dá)到最大值1.5?μg/mL，而對照的速效鉀含量未見增加，說明未接種ZMD02的對照中不存在從鉀長石中分解釋放出的游離態(tài)有效鉀（圖1）。故ZMD02具有解鉀活性，定性為解鉀菌。

2.2?菌株ZMD02的生長特性

由圖2可知，菌株ZMD02對5種糖源的發(fā)酵產(chǎn)氣能力存在明顯差異，由大到小依次為葡萄糖>麥芽糖>乳糖>直鏈淀粉>支鏈淀粉?？疾靂MD02對碳同化的能力時，也顯示出不同，由大到小為麥芽糖>葡萄糖>乳糖>直鏈淀粉>支鏈淀粉，說明麥芽糖是菌株生長的最佳碳源（圖3）。ZMD02對5種氮源的同化能力表現(xiàn)為酵母膏>蛋白胨>硫酸銨>硝酸鉀>尿素（圖4）。ZMD02的最適生長溫度為28?℃，低于20?℃和高于36?℃時，菌株長勢明顯減弱（圖5）。中性酸堿度環(huán)境是ZMD02的最適生長pH（圖6）。

3?討論

該研究從煙草根際土壤中分離獲得菌株ZMD02，菌株經(jīng)7?d發(fā)酵后發(fā)酵上清液中速效鉀含量達(dá)1.5?μg/mL，解鉀活性較強，無論作為誘變育種的出發(fā)菌株或直接作為生物鉀肥原始菌株，均具有較高的研究價值和開發(fā)潛力。土壤是微生物的大本營，根際環(huán)境因為植物根系活動與微生物的代謝經(jīng)過長期的協(xié)同進(jìn)化，從根際環(huán)境分離出的土著菌株，在應(yīng)用開發(fā)上具有天然的生態(tài)適應(yīng)性優(yōu)勢[12-13]，因此，ZMD02對煙草生產(chǎn)具有重要意義。雖然土壤中微生物種類繁多，但不同生境的微生物多樣性特征存在差異，很多時候即使是同一種微生物，來源不同，微生物個體的生物學(xué)特征也表現(xiàn)出特定的差異[12，14]，因此大量分離功能菌株，仍是一項非常具有價值的基礎(chǔ)性工作。

土著菌株初始酶活性的高低常常不能作為判斷該菌株是否具有價值的唯一依據(jù)，且土著野生菌株直接應(yīng)用往往出現(xiàn)田間施用效果不穩(wěn)定的情況，故后期通過紫外線、化學(xué)誘變劑等提高土著出發(fā)菌株的功能效果，幾乎是菌株深度開發(fā)的必要環(huán)節(jié)[15-17]，因此，對ZMD02的后續(xù)工作將著重加強這方面的研究。該研究對ZMD02菌株生長特性的初步探索，明確了菌株不同碳源、氮源、生長溫度和酸堿度的響應(yīng)特征，也為后期的理論和應(yīng)用研究提供了有益參考。

參考文獻(xiàn)

[1]?林先貴.土壤微生物研究原理與方法[M].北京：高等教育出版社，2010：326.

[2]?劉光燁，林洋，黃昭賢.硅酸鹽細(xì)菌解鉀兼拮抗活性菌株的篩選[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2001，7（1）：66-68.

[3]?馬娜，李嵩，孫濤，等.鉀細(xì)菌對土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化強度及馬鈴薯品質(zhì)的影響[J].中國馬鈴薯，2016，30（4）：218-225.

[4]?龔文秀，曹媛媛，倪海婷，等.煙草親和性解鉀PGPR菌株篩選及其促生效果研究[J].中國煙草學(xué)報，2016，22（1）：55-63.

[5]?樊文強，孫鑫，楊愛國，等.基于關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘煙草高鉀優(yōu)異等位變異[J].中國煙草學(xué)報，2016，22（2）：100-107.

[6]?劉璇，孔凡玉，張成省，等.煙草根際解鉀菌的篩選與鑒定[J].中國煙草科學(xué)，2012，33（3）：28-31.

[7]?吳向華，劉五星.土壤微生物生態(tài)工程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012：94-96.

[8]?袁振宏.能源微生物學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012：2-5.

[9]?張愛民，張雙鳳，趙鋼勇，等.膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑的研制及在煙草上的應(yīng)用[J].河北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，33（4）：387-393.

[10]?楊汝德.現(xiàn)代工業(yè)微生物學(xué)實驗技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2009：254.

[11]?王珣玨，黃曉云，蔡鵬，等.解鉀菌解鉀效率檢測方法的比較[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，35（1）：81-85.

[12]?徐麗華，婁愷，張華，等.微生物資源學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，2010：138-140，206-216.

[13]??燕紅，代英杰，彭顯龍.微生物資源及利用[M].哈爾濱：哈爾濱工程大學(xué)出版社，2012：258-264.

[14]?王國惠.環(huán)境工程微生物學(xué)——原理與應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015：164-166.

[15]?施巧琴，吳松剛.工業(yè)微生物育種學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2009：95-98.

[16]?黃小云，林娟，林小洪，等.產(chǎn)木聚糖酶海洋微生物的篩選與誘變育種[J].福州大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，43（5）：715-721.

[17]?刁治民，周富強，高曉杰，等?農(nóng)業(yè)微生物生態(tài)學(xué)[M].成都：西南交通大學(xué)出版社，2008：231-234.