董帥 陳翠玲 朱培芳 周志宏 馬曉霞

摘要：目的? 采用HPLC測定云南不同產(chǎn)地的野生與栽培黃草烏中滇烏堿、黃草烏堿甲及黃草烏堿丙的含量。方法? 采用Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A為乙腈、B為40 mmol/L乙酸銨緩沖液（用氨水調(diào)pH值至9.00），兩相梯度洗脫（0～35 min，35%→55%A;35～40 min，55%A），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，波長260 nm。結(jié)果? 7個產(chǎn)地野生與栽培黃草烏中滇烏堿含量為510.29～1837.44 μg/g，新平產(chǎn)野生黃草烏最高，建水栽培者最低;黃草烏堿甲含量為583.92～4105.45 μg/g，個舊栽培黃草烏（黃皮）最高，建水栽培者最低;黃草烏堿丙含量為79.93～2281.68 μg/g，嵩明產(chǎn)野生黃草烏最高，建水栽培者最低。3種雙酯型二萜生物堿總含量為1240.32～5732.09 μg/g。HPLC對比圖顯示，黃草烏栽培品與野生品成分存在較大差異。結(jié)論? 黃草烏野生品與栽培品存在明顯成分差異，3種雙酯型生物堿含量差異很大，不同產(chǎn)地的栽培品之間也有明顯差異。

關(guān)鍵詞：黃草烏;野生品;栽培品;雙酯型二萜生物堿;高效液相色譜法

中圖分類號：R284.1? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）04-0074-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201906004

HPLC Determination of Three Diester Diterpenoid Alkaloids of Wild and Cultivated

Aconitum Vilmorinianum Radix from Different Producing Areas in Yunnan Province

DONG Shuai1， CHEN Cuiling2， ZHU Peifang1， ZHOU Zhihong1， MA Xiaoxia1

1.Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China;

2. Wuzhou Institute for Food and Drug Control， Wuzhou 543002， China

Abstract： Objective To determine the contents of yunaconitine， vilmorrianine A and vilmorrianine C of wild and cultivated Aconitum Vilmorinianum Radix from different producing areas in Yunnan Province by HPLC. Methods Extend-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used. The mobile phase was consisted of acetonitrile （A）?40 mmol/L ammonium acetate buffer （adjust the pH to 9.00 with ammonia， B） with gradient elution （0?35 min， 35%→55% A; 35?40 min， 55% A） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃ and the wavelength was set at 260 nm. Results The contents of yunaconitine in eight samples of Aconitum Vilmoriniani Radix ranged from 510.29 to 1837.44 μg/g， with the highest in wild materials grown in Xinping and the lowest in materials cultivated in Jianshui. The contents of vilmorrianine A ranged from 583.9 to 4105.45 μg/g， with the highest in materials cultivated in Gejiu with yellow root bark and the lowest in materials cultivated in Jianshui. The contents of vilmorrianine C ranged from 79.93 to 2281.68 μg/g， with the highest in wild materials grown in Songming and the lowest in materials cultivated in Jianshui. The total contents of these three diester diterpenoid alkaloids ranged from 1240.32 to 5732.09 μg/g. There were also notable differences in the constituents between wild and cultivated Aconitum Vilmorinianum Radix. Conclusion The wild and cultivated Aconitum Vilmorinianum Radix have distinct differences both in the constituents and in the contents of the three diester diterpenoid alkaloids. The cultivated materials from different producing areas also exhibit obvious difference in the contents of constituents.

Keywords： Aconitum Vilmorinianum Radix; wild products; cultivated products; diester diterpenoid alkaloids; HPLC

黃草烏Aconitum vilmorinianum Kom.為毛茛科Ranunculaceae烏頭屬Aconitum多年生藤本植物，生長于海拔2100～2500 m的山地灌叢中，主產(chǎn)于云南中部和西部地區(qū)，在四川（會理）及貴州西部亦有分布[1]，其藥用部位為根。黃草烏藥材味苦、辛、麻，性溫，有劇毒，具有祛風散寒、除濕止痛功效，臨床用于治療跌打損傷、風濕關(guān)節(jié)疼痛、手足厥冷等，收載于2005年版《云南省中藥材標準》[2]。由于野生黃草烏遭到過度采挖，其分布區(qū)銳減，野生資源瀕臨枯竭。近年來人工栽培黃草烏獲得成功，有效解決了資源供應(yīng)問題[3-5]，但野生品與栽培品之間的成分差異未引起足夠重視。目前云南省種植黃草烏的地區(qū)較多，不同產(chǎn)地栽培品的質(zhì)量差異問題未見相關(guān)報道。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，本試驗采用HPLC，以黃草烏中主要雙酯型二萜生物堿成分（滇烏堿、黃草烏堿甲和黃草烏堿丙）為檢測指標[6]，對云南3個不同地區(qū)的黃草烏野生品和4個不同產(chǎn)區(qū)的黃草烏栽培品（其中個舊栽培基地有紫皮和黃皮2個品種）進行含量檢測，以期為黃草烏藥材的規(guī)范種植提供依據(jù)。

1? 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（包括四元泵、DAD檢測器、柱溫箱、自動進樣器），HU-10260F超聲清洗儀器（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司），DFT-200手提式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司），AUW220D電子分析天平（日本島津）。

對照品滇烏堿、黃草烏堿甲和黃草烏堿丙，均為本試驗室從黃草烏藥材中分離得到，經(jīng)HPLC分析（檢測波長260 nm），純度分別為98.72%、98.38%、98.84%。黃草烏樣品經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院譚文紅主任藥師鑒定為毛茛科烏頭屬植物黃草烏A. vilmorinianum Kom.的根，藥材標本存放于云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省中醫(yī)藥民族醫(yī)藥博物館，來源信息見表1。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，乙酸銨、氨水、異丙醇、乙酸乙酯、鹽酸均為分析純。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 溶液制備

2.1.1? 對照品溶液

取對照品滇烏堿、黃草烏堿甲、黃草烏堿丙各適量，精密稱定，加0.1%鹽酸甲醇制成濃度分別為滇烏堿75.60 μg/mL、黃草烏堿甲81.70 μg/mL、黃草烏堿丙78.20 μg/mL的混合溶液。

2.1.2? 供試品溶液

黃草烏樣品粉碎，過60目篩，得細粉，精密稱取2.00 g，置具塞錐形瓶中，加25%氨水3 mL潤濕。精密加入萃取溶劑異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾。精密量取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收至干。殘渣用0.10%鹽酸甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2? 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為Zorbax Extend C-18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為乙腈、B為40 mmol/L乙酸銨緩沖液（氨水調(diào)pH值至9.00），兩相梯度洗脫（0～35 min，35%→55%A;35～45 min，55%A），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，檢測波長260 nm。滇烏堿、黃草烏堿甲和黃草烏堿丙的保留時間分別為21.675、28.749、37.727 min。色譜圖見圖1。

2.3? 方法學(xué)考察

2.3.1? 線性關(guān)系考察

取混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件，分別自動進樣2、5、10、15、25 μL，記錄色譜圖。分別以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析，得3種成分的回歸方程，結(jié)果3種成分在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

2.3.2? 精密度試驗

取同一混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件，連續(xù)自動進樣10 μL，共6次，記錄色譜圖。結(jié)果滇烏堿、黃草烏堿甲、黃草烏堿丙的峰面積RSD分別為0.58%、0.69%、0.83%，表明儀器精密度良好。

2.3.3? 穩(wěn)定性試驗

取制備好的同一樣品（S1）的供試品溶液，室溫放置，按“2.2”項下色譜條件，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h進樣10 μL，記錄色譜圖。結(jié)果滇烏堿、黃草烏堿甲和黃草烏堿丙的峰面積RSD分別為1.69%、1.36%、1.02%，表明供試品溶液中3個待測成分在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.4? 重復(fù)性試驗

取同一批號黃草烏樣品（S1），分別按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別進樣10 μL，測定3個成分含量。結(jié)果樣品中滇烏堿、黃草烏堿甲和黃草烏堿丙的平均含量分別為678.00、736.00、485.00 μg/g，RSD分別為1.20%、1.33%、1.10%，表明重復(fù)性良好。

2.3.5? 加樣回收率試驗

精密稱取已知成分含量的黃草烏樣品（S1）粉末1.00 g，共6份，分別精密加入一定量的對照品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表3。

2.4? 樣品測定

按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下條件測定7個不同地區(qū)共8批黃草烏樣品中滇烏堿、黃草烏堿甲、黃草烏堿丙的含量（以干燥品計），結(jié)果見表4。

2.5? 色譜圖匯總對比

為更直觀對比不同黃草烏樣品的成分，8個樣品的HPLC圖匯總見圖2。

3? 討論

本研究結(jié)果顯示，野生黃草烏中黃草烏堿甲含量普遍高于滇烏堿，但二者差異不大，黃草烏堿丙含量僅嵩明產(chǎn)者明顯較高，其他兩產(chǎn)地均低。栽培品中，黃草烏堿丙含量普遍較低，但黃草烏堿甲和滇烏堿的含量沒有規(guī)律性，瀘西種植基地和個舊種植基地樣品（黃皮）的黃草烏堿甲含量約為滇烏堿的3倍，祿勸和建水的栽培品中二者含量接近，但均較低，而個舊種植基地樣品（紫皮）的滇烏堿含量明顯高于黃草烏堿甲。從3種成分的總含量來看，不同產(chǎn)地栽培品之間的差異程度大于不同產(chǎn)地野生品之間的差異?？梢娙斯しN植的產(chǎn)地選擇對黃草烏主要成分含量的影響非常明顯。紫皮與黃皮黃草烏成分差異的根本原因還需進一步研究。

從HPLC匯總圖看，黃草烏栽培品在黃草烏堿甲峰之后均出現(xiàn)一個含量不低的未知成分峰，此物質(zhì)在3個產(chǎn)地的野生品中含量均很低。在黃草烏堿丙峰前后觀察到2個未知成分峰，它們在栽培品中的含量均高于野生品。可見，人工栽培會導(dǎo)致黃草烏中一些成分含量明顯升高。由于烏頭屬植物遺傳變異豐富[7]，因此有必要對這些差異性成分進行研究，明確其化學(xué)本質(zhì)及對黃草烏藥效和毒性的影響。

本試驗前期對黃草烏野生品的分析條件中，采用流動相A為乙腈、B為40 mmoL/L乙酸銨緩沖液（氨水調(diào)pH值至9.0～10.0），兩相梯度洗脫（0～30 min，35%→55%A;30～40 min，55%→35%A[6]。由于在栽培品中發(fā)現(xiàn)保留時間與黃草烏堿甲非常接近的未知成分，筆者進行了流動相比例調(diào)整，并將流動相緩沖鹽的pH值確定為9.0。

本試驗收集了7個產(chǎn)地的黃草烏樣品，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，其主要毒性成分雙酯型二萜生物堿含量有明顯差異。目前制藥生產(chǎn)中均使用黃草烏栽培品，黃草烏作為一種毒性藥材，其毒性成分含量與藥物安全性密切相關(guān)，因此，是否有必要限定黃草烏的種植區(qū)域，還需進一步廣泛收集不同產(chǎn)地樣品，分析其成分含量，并開展毒性和有效性評價。黃草烏經(jīng)人工栽培后產(chǎn)生了一些與野生品不同的成分，值得進一步深入研究。

參考文獻：

[1] 中國科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志（第十一卷）[M].北京：科學(xué)出版社，2000：89-91.

[2] 云南省食品藥品監(jiān)督管理局.云南省中藥材標準：2005年版第七冊[M].昆明：云南科技出版社，2013：69-70.

[3] 李雪佩，何俊，賀水蓮，等.黃草烏植物的研究進展[J].西部林業(yè)科學(xué)， 2017，46（6）：1-7.

[4] 鄧廷豐，李培清.云南野生滇南黃草烏人工馴化栽培技術(shù)[J].農(nóng)村實用技術(shù)，2001（1）：15-19.

[5] 李明福.滇中黃草烏資源開發(fā)及種植技術(shù)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（1）：11-12.

[6] 馬曉霞，周志宏，譚文紅，等.一種同時測定黃草烏藥材中3種雙酯型二萜生物堿類似物的方法：ZL201510101844.X[P].2016-06-29.

[7] 周天華，黎君，楊恒.烏頭及其同屬近緣種的SSR指紋圖譜研究[J].西北植物學(xué)報，2017，37（12）：2378-2388.

（收稿日期：2019-06-01）

（修回日期：2019-06-23;編輯：陳靜）

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81260626）;云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究-中醫(yī)聯(lián)合專項（2015FB205-007）

通訊作者：馬曉霞，E?mail：13708763980@163.com