邢樂康，鄧永東，姚立瓊，金鳳玲

肝硬化是臨床常見的慢性肝病，乙型肝炎病毒(HBV)感染為該病的主要病因之一。肝硬化后期常引起消化道出血、肝性腦病和腹水等一系列并發(fā)癥，導(dǎo)致患者死亡。現(xiàn)有眾多研究[1]表明乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群會發(fā)生變化，并通過“腸-肝軸(gut-liver axis)”[2]使肝臟Kupffer細(xì)胞吞噬功能受損和炎癥因子釋放，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，加重疾病的嚴(yán)重程度。有研究表明[3]膳食結(jié)構(gòu)會影響腸道菌群的變化，研究不同地區(qū)不同程度乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群變化的特點(diǎn)對治療有重要的意義。本研究分析了乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群的變化特征，旨在為臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018年7月～2019年4月我院收治的乙型肝炎肝硬化患者103例，男68例，女35例；年齡26～61歲，平均年齡為(46.4±3.1)歲。診斷符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會和感染病學(xué)分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》 (2015年版)[4]的標(biāo)準(zhǔn)，其中代償期41例，失代償期62例。入組患者在納入研究一個月前均未接受抗生素或腸道菌群調(diào)節(jié)藥物治療。另選擇在本院體檢的健康志愿者20例，男11例，女9例；年齡21～59歲，平均年齡為(44.6±4.1)歲。本研究經(jīng)蘭州大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 腸道菌群檢測 采用Illumina Miseq高通量測序方法檢測腸道菌群序列(上海凌恩生物技術(shù)公司)，并提取高質(zhì)量序列，對其進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析，分析多樣性指數(shù)和群落結(jié)構(gòu)。大致測序過程如下：(1)抽提基因組DNA，完成后在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照指定測序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物，并在2%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測。PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase。使用ABI GeneAmp? 9700型PCR擴(kuò)增儀；(3)參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量檢測；(4)構(gòu)建Illumina PE250文庫。對測序結(jié)果進(jìn)行overlap關(guān)系拼接，同時對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，并進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析。在上述分析的基礎(chǔ)上，再對一系列群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等進(jìn)行深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 菌群結(jié)構(gòu)分布分析 基于門等級水平，通過研究共鑒定出15種細(xì)菌，其中厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)分別占總數(shù)的62.3%和26.2%，其次為梭菌門(Fusobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，共占比為10.7%，而黏膠球菌形菌門(Lentisphaerae)、酸桿菌門(Acidobacteria)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、廣古生菌門(Euryarchaeota)和奇古生菌門(Thaumarchaeota)等含量極低。在健康人、代償期和失代償期肝硬化組，厚壁菌門和擬桿菌門分別為70.9%和64.2%、57.7%和18.6%，和26.7%和28.9%；在屬分類等級水平上，我們共鑒定出300余種細(xì)菌，其中占比最高的為擬桿菌屬(Bacteroides)占14.5%，其次為糞桿菌屬(Faecalibacterium)占10.2%和巨單胞菌屬(Megamonas)占8.4%，而普氏菌屬(Prevotella )、韋榮球菌屬(Veillonella)和羅斯氏菌屬(Roseburia)等占比較低，均小于5%；在健康人，巨單胞菌屬、擬桿菌屬和糞桿菌屬比例較高，分別為14.8%、11.4%和9.8%。在代償期肝硬化組，擬桿菌屬、糞桿菌屬和巨單胞菌屬比例分別為15.2%、11.5%和11.2%。在失代償期肝硬化組，擬桿菌屬、糞桿菌屬和韋榮球菌屬比例分別為16.9%、9.6%和9.2%。

2.2 腸道菌群多樣性分析 在群落生態(tài)學(xué)中研究微生物多樣性，通過單樣本的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，通常運(yùn)用Chao指數(shù)來計(jì)算菌群豐度。Chao指數(shù)在生態(tài)學(xué)研究中常用來估算物種總數(shù)，而運(yùn)用Shannon和Simpson指數(shù)來計(jì)算菌群多樣性，Shannon指數(shù)越高，說明菌群多樣性越高，而Simpson指數(shù)越高，說明菌群多樣性越低。研究發(fā)現(xiàn)，健康人Chao指數(shù)顯著高于代償期肝硬化組和失代償期肝硬化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，與健康人群比，失代償期肝硬化患者腸道菌群豐度明顯降低，且失代償期肝硬化患者腸道菌群豐度顯著低于代償期肝硬化患者。經(jīng)方差分析，健康人Shannon指數(shù)顯著低于代償期肝硬化組和失代償期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。健康人Simpson指數(shù)顯著大于代償期和失代償期肝硬化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)，而稀釋曲線趨于平坦(圖1)，說明測序結(jié)果可反映樣本菌群的多樣性。對樣本進(jìn)行PCOA分析后發(fā)現(xiàn)，大部分失代償期乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群存在聚集，與健康人和代償期肝硬化患者有明顯差異，第一主成分貢獻(xiàn)率為23.7%，第2主成分貢獻(xiàn)率為18.7%(圖2)。

表1 肝硬化與健康人腸道菌群豐度和多樣性比較

與健康人比，①P<0.05

圖1 研究對象腸道菌群稀釋曲線

圖2 研究對象腸道菌群PCOA分析

2.3 腸道菌群差異分析 LEfSE分析方法采用線性判別分析(LDA)估算每個組分(物種)豐度對差異效果影響的大小，通過分析可以發(fā)現(xiàn)組間差異顯著的菌種。本研究在健康人，厚壁菌門中的毛螺菌科Lachnoclostridium屬和Ruminococcaceae科Ruminiclostridium-5屬對菌群差異起到重要作用，在失代償期肝硬化組，厚壁菌門中的Veillonellaceae科Veillonella屬起到重要作用(圖3)。

圖3 失代償期肝硬化患者與健康人腸道菌群差異分析

3 討論

腸道菌群是人體重要的定植菌群之一，有著免疫調(diào)節(jié)、病原體防御和物質(zhì)代謝等生理功能。一般，正常腸道菌群分為益生菌、中性菌和有害菌。當(dāng)菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時，一些炎癥介質(zhì)和內(nèi)毒素的釋放將導(dǎo)致腸道屏障被破壞，引起疾病的發(fā)生，且這些有害代謝產(chǎn)物還可通過腸-肝軸運(yùn)輸至肝臟，破壞其結(jié)構(gòu)和并使其功能受損。對腸道菌群進(jìn)行調(diào)節(jié)，現(xiàn)已逐漸成為臨床治療肝臟疾病的有效手段之一[5]。

現(xiàn)有眾多研究表明，乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且隨著病情的發(fā)展而變化[6，7]。本研究結(jié)果顯示，相對于健康人群，乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群中擬桿菌屬細(xì)菌數(shù)量呈升高趨勢，厚壁菌門/擬桿菌門細(xì)菌比例下降，且與疾病的嚴(yán)重程度呈正比，而巨單胞菌屬和糞球菌屬細(xì)菌數(shù)量下降，在失代償期肝硬化患者中韋榮球菌屬細(xì)菌數(shù)量上升。該研究結(jié)果與國內(nèi)研究報道基本相似[8]，而國外有學(xué)者檢測發(fā)現(xiàn)[9]，乙型肝炎肝硬化患者腸道腸桿菌科、梭桿菌科和產(chǎn)堿桿菌科細(xì)菌數(shù)量上升，而瘤胃菌科和毛螺菌科細(xì)菌數(shù)量下降。檢測結(jié)果可能受到疾病種類和當(dāng)?shù)仫嬍沉?xí)慣的共同影響。巨單胞菌屬和糞球菌屬細(xì)菌均可代謝短鏈脂肪酸，調(diào)節(jié)腸道免疫功能和物質(zhì)代謝[10]，而現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)瘤胃菌科和毛螺菌科細(xì)菌多數(shù)含有膽汁酸水解酶，與次級膽汁酸的產(chǎn)生密切相關(guān)[11]，而膽汁酸可以刺激腸壁，破壞腸道微生態(tài)和機(jī)體免疫功能，影響機(jī)體對腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)。也有研究發(fā)現(xiàn)在肝硬化患者腸道內(nèi)腸桿菌科和擬桿菌科細(xì)菌更豐富，且菌群改變程度與疾病發(fā)展程度相關(guān)[11-15]。

同樣，飲食習(xí)慣因素也能調(diào)節(jié)腸道微生物的組成。有國內(nèi)學(xué)者提出[16]，脂肪攝入的數(shù)量和類型均會影響腸道菌群的組成，而厚壁菌門細(xì)菌含有與脂肪或難消化的多糖代謝相關(guān)的基因，故這種菌群與肥胖相關(guān)，擬桿菌門的作用與其相反，所以在高脂飲食人群中可能會發(fā)生腸道內(nèi)厚壁菌/擬桿菌比值升高的現(xiàn)象。失代償期乙型肝炎肝硬化患者腸道微生物多樣性明顯降低，飲食因素如咖啡、蔬菜和發(fā)酵乳的攝入可增加菌群的多樣性，而乳果糖和碳酸飲料的飲用將降低腸道微生物的多樣性[17]。我國漢族人飲食以米、面食和肉類為主，這種高蛋白質(zhì)及高脂飲食習(xí)慣會造成擬桿菌屬細(xì)菌數(shù)量的上升[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在失代償期乙型肝炎肝硬化患者腸道中韋榮球菌屬豐度上升，而韋榮球菌屬可通過與鏈球菌屬的協(xié)調(diào)作用，從而釋放內(nèi)毒素和炎癥因子等，破壞腸道屏障功能[15]，屬于條件致病菌導(dǎo)致的腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡。失衡的腸道菌群所產(chǎn)生的代謝毒物等可通過“腸-肝軸”對肝臟結(jié)構(gòu)進(jìn)一步造成破壞[19-21]，同時腸道動力學(xué)的改變和胃腸pH環(huán)境變化都會導(dǎo)致肝硬化患者病情不斷加重而向失代償期發(fā)展。

綜上所述，乙型肝炎肝硬化患者的確存在不同程度的腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡和數(shù)量改變現(xiàn)象。隨著病情發(fā)展，患者腸道菌群也在發(fā)生變化，而菌群失衡常導(dǎo)致病情的加重。目前，有學(xué)者提出糞便移植等新興治療方法[17]，這些手段還需要更多的探索和觀察。不同地區(qū)乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群特點(diǎn)存在差異，可能與疾病病因、病情、飲食習(xí)慣和治療干預(yù)等有關(guān)。臨床醫(yī)生可根據(jù)具體情況對乙型肝炎肝硬化患者進(jìn)行個體化的治療，找到最合適的治療方案，盡可能減少對腸道菌群的破壞，從而達(dá)到更好的療效。