程艷芬，鮑恩東，耿雪冉，徐麗婧，羅華，孟俊龍

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

熱應(yīng)激是一種非特異的全身性反應(yīng)，溫度升高幾度即可對(duì)畜禽的生長(zhǎng)、繁殖、免疫等產(chǎn)生不利影響，且易導(dǎo)致畜禽的猝死[1]。造成動(dòng)物熱應(yīng)激猝死的原因可能是熱應(yīng)激導(dǎo)致動(dòng)物的重要生命器官(如心臟)受到嚴(yán)重的病理性損傷[2]。熱休克蛋白(Heat shock protein，HSPs)對(duì)熱應(yīng)激具有復(fù)雜的保護(hù)機(jī)制。根據(jù)其分子量的大小分為HSP90、HSP70、HSP60和小HSPs四大類[3]。Hsp60作為熱休克蛋白家族重要成員之一，在原核生物和真核生物中作為細(xì)胞內(nèi)某些功能蛋白的分子伴侶，幫助肽鏈折疊和伸展、聚合和解聚、變性蛋白降解和清除，以維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞的生理功能[4]。

Hsp60在體內(nèi)的含量及分布的變化與多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，特別是心血管系統(tǒng)疾病[5]。血清中Hsp60的含量被認(rèn)為是疾病發(fā)展的潛在生物標(biāo)記之一[6]。然而，Hsp60的功能是具有爭(zhēng)議的，目前報(bào)道其既具有促存活功能，也具有促凋亡功能[7]。為探討心肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的Hsp60對(duì)熱應(yīng)激H9C2大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)理，本研究在H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入等量的山羊抗鼠IgG和Hsp60抗體，以中和各種原因?qū)е碌姆植荚谛募〖?xì)胞外膜及胞外的Hsp60；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、熒光定量PCR、Western Blotting等方法檢測(cè)熱應(yīng)激導(dǎo)致的H9C2心肌細(xì)胞的凋亡情況，并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行初步研究。本研究可為進(jìn)一步探求分布在胞外的Hsp60對(duì)熱應(yīng)激心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

H9C2大鼠心肌細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)收集所(ATCC)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-APC，KGA1024)為中國(guó)南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；SB203580(s1863)、PD98059(s1805)、SP600125(s1876)購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。Rat heat shock protein 60 ELISA kit 購(gòu)自Enzo生物科學(xué)公司。P44/42 MAPK(ERK1/2)、p-P44/42 MAPK(ERK1/2)、SAPK/JNK、p-SAPK/JNK等抗體購(gòu)自美國(guó)cell signaling technology公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 H9C2大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

從液氮中取出H9C2大鼠心肌細(xì)胞冷凍管，迅速投入37 ℃水浴中，使其完全融化。37 ℃預(yù)熱的含8%胎牛血清的DMEM新鮮培養(yǎng)液置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液，直至細(xì)胞發(fā)生90%融合，進(jìn)行細(xì)胞傳代。加入數(shù)滴0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞，顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，待所有細(xì)胞變圓且大部分由貼壁狀態(tài)轉(zhuǎn)為懸浮傾向時(shí)，在超凈工作臺(tái)中加入含血清的培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)，用吸管反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞(吹打過(guò)程中盡量不形成氣泡)，形成細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞90%融合時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 H9C2大鼠心肌細(xì)胞上清Hsp60的檢測(cè)

根據(jù)Rat heat shock protein 60 ELISA kit的操作要求，檢測(cè)對(duì)照組和熱應(yīng)激組[(42±1)℃熱應(yīng)激2 h]心肌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中的Hsp60。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞的損傷

在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2大鼠心肌細(xì)胞中分別加入MAPK抑制劑；作用0.5 h后，進(jìn)行熱應(yīng)激處理。消化、收集心肌細(xì)胞；加入500 μL的Binding Buffer懸浮心肌細(xì)胞，2～8 ℃避光孵育15 min；加入5 μL Annexin V-APC，混勻后，加入5 μL 7-AAD，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡壞死的情況。

1.2.4 Western Blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

按程艷芬[8，12]的方法，將收集到的H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行裂解并提取總蛋白。用BCA法測(cè)蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)電泳后轉(zhuǎn)膜，經(jīng)過(guò)封閉、一抗、HRP標(biāo)記的二抗、發(fā)光底物的孵育，于化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行分析。使用Quantity one(bio-rad)軟件對(duì)相關(guān)條帶進(jìn)行定量分析，以β-Actin作為內(nèi)參。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)

按程艷芬[8，12]的方法，按照說(shuō)明書從H9C2心肌細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)體系由12.5 μL SYBR@PremixExTaqⅡ，1 μL上游引物，1 μL下游引物，90 ng cDNA和DEPC水組成，終體積為25 μL。PCR共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，具體為：預(yù)變性階段，95 ℃ 1 min；三步法擴(kuò)增：95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；72 ℃ 30 min。引物：Bax：F 5′-GGATGCGTCCACCAAGAAG-3′, R 5′-CAAAGTAGAAGAGGGCAACGAC-3′；Bcl-2：F 5′-TGTGGTCCATCTGACGCTCC-3′,R 5′-ACATCTCCGTGTTGAGCCTCT-3′；β-Actin：F 5′-TGCGGAAGTTAGGTTTTGTCA-3′, R 5′-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3′。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)3次重復(fù)。數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激對(duì)H9C2心肌細(xì)胞凋亡和壞死的影響

不同時(shí)間的熱應(yīng)激處理導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和壞死情況如圖1所示。對(duì)照組心肌細(xì)胞約有3.2%處于凋亡的不同階段，約1.87%死亡，可能與細(xì)胞新陳代謝或凋亡檢測(cè)過(guò)程中消化、雙染及收集細(xì)胞的操作有關(guān)。經(jīng)過(guò)1 h的熱應(yīng)激處理，9.57%的心肌細(xì)胞處于凋亡的不同階段，壞死細(xì)胞約占3.35%，與對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)。熱應(yīng)激2 h后，16.61%的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，10.74%的細(xì)胞壞死，與對(duì)照組相比，差異極顯著(P<0.01)。熱應(yīng)激4 h后，超過(guò)一半的細(xì)胞發(fā)生開(kāi)始凋亡壞死，壞死細(xì)胞約占43.5%，與對(duì)照組心肌細(xì)胞的損傷率相比，差異極顯著(P<0.01)。

2.2 熱應(yīng)激前后H9C2大鼠心肌細(xì)胞上清液Hsp60的檢測(cè)

熱應(yīng)激前后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的Hsp60如圖2所示，與熱應(yīng)激前相比，2 h的熱應(yīng)激使得心肌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中的Hsp60蛋白極顯著增加(P<0.01)。這些增加的Hsp60可能由熱應(yīng)激導(dǎo)致的壞死心肌細(xì)胞釋放或者熱應(yīng)激導(dǎo)致Hsp60由線粒體遷移至心肌細(xì)胞膜或跨越細(xì)胞膜到培養(yǎng)上清液中。

2.3 抑制細(xì)胞膜和胞外的Hsp60對(duì)熱應(yīng)激H9C2大鼠心肌細(xì)胞損傷的影響

在H9C2大鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入過(guò)量的山羊抗鼠Hsp60抗體或IgG，約10 μg·mL-1，熱應(yīng)激處理2 h后，流式細(xì)胞檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡壞死情況，結(jié)果如圖3所示。與未加Hsp60抗體組即anti-Hsp60(-)相比，Hsp60抗體組即anti-Hsp60(+)心肌細(xì)胞的凋亡和壞死損傷加劇，差異極顯著(P<0.01)。可能是由于外源性的Hsp60抗體與細(xì)胞外及細(xì)胞膜表面的Hsp60形成抗原抗體復(fù)合物，使得熱應(yīng)激導(dǎo)致的遷移到細(xì)胞外膜或胞外的Hsp60不能發(fā)揮其生理功能，不再對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。胞外膜或胞外的Hsp60失活后，心肌細(xì)胞凋亡壞死損傷加劇，由此推測(cè)，細(xì)胞膜及細(xì)胞外的Hsp60可以在一定程度上保護(hù)細(xì)胞，減少心肌細(xì)胞的凋亡和壞死。

2.4 抑制細(xì)胞膜和胞外的Hsp60對(duì)熱應(yīng)激H9C2心肌細(xì)胞損傷相關(guān)基因的影響

在H9C2大鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入過(guò)量的山羊抗鼠Hsp60抗體或IgG，約10 μg·mL-1，熱應(yīng)激處理2 h后，收集心肌細(xì)胞，熒光定量檢測(cè)方法檢測(cè)Bcl-2和Bax的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示，與anti-Hsp60(-)相比，anti-Hsp60(+)心肌細(xì)胞內(nèi)Bax的表達(dá)量升高約51倍，差異極顯著(P<0.01)。而且anti-Hsp60(+)心肌細(xì)胞Bax/Bcl-2的比值比anti-Hsp60(-)高36倍。可見(jiàn)，熱應(yīng)激過(guò)程中遷移到大鼠心肌細(xì)胞外膜及胞外的Hsp60可能對(duì)熱應(yīng)激心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制細(xì)胞的凋亡和損傷實(shí)現(xiàn)的。

表1 抑制細(xì)胞外的Hsp60對(duì)熱應(yīng)激H9C2心肌細(xì)胞Bax和Bcl-2基因的影響

Table 1 Effects of Hsp60’s transmembrane on expression of apoptosis genes in H9C2myocardial cells induced by heat stress

anti-Hsp60(-)anti-Hsp60(+)BaxmRNA1.1±0.351.4±2.7??Bcl2mRNA0.7±0.050.9±0.06

注：結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，“*”表示差異顯著(P<0.05), “**”表示差異極顯著(P<0.01)

Note：Values represent the mean ± standard deviation.“*”P<0.05 and “**”P<0.01 compared to the controls

2.5 抑制ERK和JNK的活化對(duì)熱應(yīng)激H9C2細(xì)胞損傷的影響

在H9C2心肌細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入MAPK通路相關(guān)蛋白的抑制劑SB203580(P38抑制劑)、PD98059(ERK抑制劑)、SP600125(JNK抑制劑)后，再加入山羊抗鼠Hsp60抗體或IgG，0.5 h后，熱應(yīng)激處理2 h。由圖5可見(jiàn)，加入抑制劑SB203580，Hsp60抗體的加入對(duì)H9C2心肌細(xì)胞的凋亡壞死率無(wú)顯著影響；加入PD98059后，與IgG組相比，Hsp60抗體組心肌細(xì)胞的凋亡壞死率顯著降低(P<0.01)；相反，加入SP600125后，Hsp60抗體組心肌細(xì)胞的凋亡壞死率顯著升高(P<0.01)，且升高幅度較大，約一倍以上。因此，熱應(yīng)激過(guò)程中遷移到大鼠心肌細(xì)胞外膜及胞外的Hsp60對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用可能是通過(guò)促進(jìn)MAPK通路相關(guān)蛋白ERK的磷酸化，抑制JNK的磷酸化，進(jìn)而緩解細(xì)胞的凋亡和壞死實(shí)現(xiàn)的，該過(guò)程與MAPK通路相關(guān)蛋白P38的磷酸化關(guān)系不顯著。

2.6 抑制細(xì)胞膜和胞外的Hsp60對(duì)熱應(yīng)激H9C2心肌細(xì)胞ERK和JNK蛋白磷酸化的影響

在H9C2心肌細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入10 μg·mL-1的山羊抗鼠Hsp60抗體，0.5 h后，熱應(yīng)激處理2 h。收集心肌細(xì)胞并提取總蛋白，檢測(cè)總蛋白中ERK和P-ERK，JNK和P-JNK兩對(duì)蛋白的表達(dá)水平(圖6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞膜和胞外的Hsp60無(wú)法作用于細(xì)胞時(shí)，H9C2心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)熱應(yīng)激處理后，ERK的磷酸化顯著降低(P<0.01)而JNK的磷酸化顯著升高(P<0.01)。進(jìn)一步表明，熱應(yīng)激過(guò)程中遷移到大鼠心肌細(xì)胞外膜及胞外的Hsp60對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)MAPK通路相關(guān)蛋白ERK的磷酸化，抑制JNK的磷酸化，進(jìn)而緩解細(xì)胞的凋亡和壞死實(shí)現(xiàn)的。

3 討論

生物體能夠適應(yīng)的生長(zhǎng)溫度是從水的冰點(diǎn)到113 ℃。作為一個(gè)主要的應(yīng)激源，熱對(duì)生命來(lái)說(shuō)是一個(gè)重要的障礙。對(duì)于所有生物來(lái)說(shuō)，略高于其最適溫度的溫度對(duì)其生存是一種挑戰(zhàn)。心臟作為機(jī)體最重要的器官之一，其損傷是致命的。隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，H9C2大鼠心肌細(xì)胞的凋亡壞死率逐漸升高[8]，與本研究結(jié)果一致。熱應(yīng)激處理2 h后，與熱應(yīng)激前相比，H9C2大鼠心肌細(xì)胞的凋亡率顯著提高(P<0.01)，因此，在后續(xù)的機(jī)理研究中熱應(yīng)激的處理時(shí)間定為2 h。

Hsp60在生物進(jìn)化上是高度保守的蛋白質(zhì)，Hsp60通常位于線粒體，在應(yīng)激狀態(tài)下，如心臟缺血[9]、癌癥[10]及實(shí)驗(yàn)性自身免疫型疾病[11]等時(shí)，Hsp60的表達(dá)被激活，其定位可以遷移到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜或細(xì)胞外。在這種情況下，發(fā)生遷移的Hsp60具有兩種形式：Hsp60和被稱為幼稚Hsp60的前體，在某種程度上，Hsp60的這兩種形式在細(xì)胞凋亡機(jī)制中發(fā)揮相反的作用[10]。熱應(yīng)激條件下，心肌細(xì)胞的Hsp60有向細(xì)胞膜方向遷移的趨勢(shì)[12]，本研究中熱應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Hsp60蛋白質(zhì)含量升高，可能是由于熱應(yīng)激導(dǎo)致的壞死的心肌細(xì)胞將胞內(nèi)的Hsp60釋放出胞外，也不排除熱應(yīng)激導(dǎo)致部分Hsp60由胞內(nèi)遷移到胞外，可能存在Hsp60和被稱為幼稚Hsp60的前體兩種形式。研究表明，熱應(yīng)激條件下，Hsp60基因的沉默導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞線粒體Bax的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。本研究中，Hsp60的抗體只能將細(xì)胞外膜和胞外的Hsp60活性抑制，細(xì)胞內(nèi)仍然可以表達(dá)Hsp60，也是通過(guò)上調(diào)Bax的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，“*”表示差異顯著(P<0.05), “**”表示差異極顯著(P<0.01)

結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，“*”表示差異顯著(P<0.05), “**”表示差異極顯著(P<0.01)

本研究結(jié)果表明，熱應(yīng)激過(guò)程中遷移到大鼠心肌細(xì)胞外膜及胞外的Hsp60對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過(guò)有絲分裂蛋白激活蛋白激酶MAPK通路相關(guān)蛋白ERK的磷酸化，抑制JNK的磷酸化，進(jìn)而緩解細(xì)胞的凋亡和壞死實(shí)現(xiàn)的；與P38關(guān)系不顯著。該結(jié)果與前人在成骨細(xì)胞Hsp60對(duì)糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致骨量流失的保護(hù)作用及外源Hsp60對(duì)紫外線介導(dǎo)的上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制的研究結(jié)果是一致的。成骨細(xì)胞Hsp60表達(dá)減少后，細(xì)胞ERK蛋白的磷酸化水平降低，Bax的含量增加，骨量流失嚴(yán)重[14]。外源的Hsp60通過(guò)激活ERK蛋白的磷酸化，抑制JNK蛋白的磷酸化，從而抑制上皮細(xì)胞凋亡，保護(hù)上皮細(xì)胞免受紫外線損傷[15]。但是在人類骨髓干細(xì)胞中，Hsp60通過(guò)激活MAPK通路的P38蛋白而非JNK蛋白和ERK蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。Hsp60蛋白發(fā)揮生理功能時(shí)，對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制與細(xì)胞類型及應(yīng)激源有關(guān)。

4 結(jié)論

胞外膜或胞外的Hsp60失活后，心肌細(xì)胞凋亡壞死損傷加劇，由此推測(cè)，細(xì)胞膜及細(xì)胞外的Hsp60可以在一定程度上保護(hù)細(xì)胞，減少心肌細(xì)胞的凋亡和壞死。其機(jī)制可能是通過(guò)有絲分裂蛋白激活蛋白激酶MAPK通路相關(guān)蛋白ERK的磷酸化，抑制JNK的磷酸化，進(jìn)而緩解細(xì)胞的凋亡和壞死實(shí)現(xiàn)的。