馮寶珍，李培謙

(運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000)

茄子(SolanummelongenaL)是我國(guó)重要的蔬菜作物之一，也是設(shè)施蔬菜栽培的重要種類(lèi)。隨著栽培模式的改進(jìn)，設(shè)施蔬菜成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的重要組成部分。但由于保護(hù)地空氣濕度大、種植密度大，常導(dǎo)致茄子灰霉病發(fā)生嚴(yán)重，已成為制約茄子質(zhì)量和產(chǎn)量的重要因素[1]。

灰霉病主要由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的一類(lèi)重要病害。該病原菌在世界范圍均有分布，其寄主范圍廣泛，能夠侵染大約1 000種植物[2]?；颐共≡谥参锷L(zhǎng)過(guò)程及采后貯藏中都能發(fā)病，造成水果、蔬菜和觀賞植物組織壞死、腐爛，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，被列為世界第二嚴(yán)重的真菌病害[3]。

目前國(guó)內(nèi)外已開(kāi)始關(guān)注灰葡萄孢(B.cinerea)的種內(nèi)多樣性研究。利用RAPD[4]、RFLP[5]、AFLP[6], MP-PCR[7]、微衛(wèi)星標(biāo)記[8]以及DNA序列[9,10]均能證實(shí)灰霉病菌有豐富的多樣性。Ma[7]利用MP-PCR技術(shù)研究了美國(guó)佛羅里達(dá)州不同寄主上灰霉病菌遺傳結(jié)構(gòu)，認(rèn)為不同寄主的灰霉病菌分化程度高，菌群重組方法不一致。Leroch等[11]通過(guò)多基因測(cè)序證實(shí)德國(guó)草莓種植地灰霉菌為一個(gè)新的亞群，稱(chēng)之為Botrytis group S，與B.cinerea和B.fabae親緣關(guān)系很近，而且該亞群在德國(guó)葡萄園未發(fā)現(xiàn)。劉雙清等[12]對(duì)湖南省草莓灰霉病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)、分化及變異規(guī)律進(jìn)行分析，認(rèn)為湖南省各地草莓灰霉菌群體遺傳多樣性豐富，且遺傳差異主要來(lái)自群體內(nèi)部，與地理位置關(guān)系小。張靜[13]利用形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)對(duì)湖北省作物灰霉病菌研究，病原物鑒定出14個(gè)種，主要病原為B.cinerea。張佳[14]對(duì)我國(guó)草莓主產(chǎn)區(qū)灰霉病多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)灰霉菌株間在培養(yǎng)性狀、交配型、轉(zhuǎn)座子類(lèi)型、抗性方面均存在明顯差異。

研究灰霉菌群內(nèi)多樣性對(duì)于明確田間優(yōu)勢(shì)種群及灰霉病防治具有重要意義。本研究對(duì)運(yùn)城保護(hù)地茄子灰霉病菌表型多樣性和遺傳多樣性進(jìn)行分析，以明確茄子灰霉病原菌優(yōu)勢(shì)種群特征，為灰霉病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株分離及鑒定

供試15個(gè)茄子灰霉菌株于2017-2018年冬春季節(jié)采于山西運(yùn)城鹽湖區(qū)茄子種植保護(hù)地。采用單孢分離法獲得菌株，在PDA斜面培養(yǎng)5～7 d，置于4 ℃冰箱保存。

挑取PDA平板上培養(yǎng)3 d的菌絲于鋪有玻璃紙的新的PDA平板中央，放入20 ℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，收集菌絲。收集的菌絲在液氮中研磨，按照真菌基因組DNA提取試劑盒(北京艾萊德生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA。

將提取基因組DNA用于真菌ITS序列和灰葡萄孢特異序列PCR擴(kuò)增，以鑒定灰葡萄孢。PCR擴(kuò)增體系為：模板 1 μL，ddH2O 9.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，共25 μL。ITS序列擴(kuò)增引物為ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’),灰葡萄孢特異序列擴(kuò)增引物BCF(5’-CAGGAAACACTTTTGGGGATA-3’)和BCR(5’-GAGGGACAAGAAAATCGACTAA-3’)[15]。

反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，共35個(gè)循環(huán)；而后72 ℃下延伸10 min；最后降為16 ℃穩(wěn)定。

1.2 生物表型分析

菌株在PDA平板培養(yǎng)3 d后，用打孔器取最邊緣的菌餅轉(zhuǎn)移到新PDA平板中央，置于20 ℃恒溫箱中培養(yǎng)30 d。分別在24 h和48 h測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率。每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)。

計(jì)算公式:菌絲生長(zhǎng)速率/cm·d-1=(48 h菌落直徑-24 h菌落直徑)/2。

15 d后觀察菌株菌核形成情況,并挑取菌絲制備玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察有無(wú)分生孢子及形態(tài)。

1.3 RAPD分子標(biāo)記

本試驗(yàn)使用18條隨機(jī)引物對(duì)供試菌株DNA進(jìn)行遺傳多樣性初篩，篩選能產(chǎn)生3條帶以上、重復(fù)性好且清晰度高的引物。所用引物由上海生物工程股份有限公司合成(表1)。

將RAPD擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。確定的反應(yīng)體系為25 μL，其中ddH2O 9.5 μL，Taq Master Mix 12.5 μL，引物2 μL以及模板DNA 50 ng。擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃，4 min；94 ℃，45 s，36 ℃，45 s，72 ℃，1 min，45個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min；最后降為4 ℃穩(wěn)定。擴(kuò)增結(jié)束后，將產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠在1%的TAE緩沖液中電泳1 h，電壓120 V[16]。加入golden-view染色，在凝膠成像系統(tǒng)中成像。

表1 RAPD擴(kuò)增引物及序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果讀取多態(tài)性條帶，記錄多態(tài)性的DNA條帶數(shù)，并計(jì)算出多態(tài)性比率。將所有多態(tài)性DNA條帶中有DNA條帶的記為“1”，沒(méi)有DNA條帶的記為“0”，構(gòu)建矩陣。利用POPGEN軟件(version 1.32)計(jì)算菌株的遺傳多樣性參數(shù)，主要包括觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon信息指數(shù)(I)[17]。使用UPGMA方法進(jìn)行聚類(lèi)分析，并通過(guò)Tree plot生成系統(tǒng)樹(shù)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰霉病菌株分離及鑒定

共分離純化了15個(gè)茄子灰霉病菌株，分別命名為QZBC1-15。將這15個(gè)菌株分別提取基因組DNA后，進(jìn)行ITS 和灰葡萄孢特異引物擴(kuò)增。15個(gè)參試菌株均能擴(kuò)增出大小一致的單一條帶(圖1)，其中 ITS擴(kuò)增條帶約為550 bp，BCF/R引物擴(kuò)增條帶大小在300 bp左右，均與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明分離純化的灰霉菌株均為灰葡萄孢(B.cinerea)。

上圖為ITS擴(kuò)增結(jié)果，目的條帶在550 bp左右；下圖為灰葡萄孢特異引物BCF/R擴(kuò)增結(jié)果，目的條帶大約300 bp。M為DNA分子標(biāo)記；1～15為供試菌株；CK為樣性對(duì)照；- 為陰性對(duì)照

2.2 生物表型分析

將分離純化的15個(gè)灰葡萄孢菌株在PDA平板上于20 ℃恒溫箱中培養(yǎng)30 d，前48 h測(cè)量生長(zhǎng)速率(圖2)。15個(gè)菌株生長(zhǎng)速率存在明顯差異，其中QZBC4生長(zhǎng)最慢，為0.5 cm·d-1；其次是菌株QZBC2和QZBC6生長(zhǎng)較慢；而菌株QZBC1、8及13生長(zhǎng)較快，達(dá)到1.4 cm·d-1。

圖2 茄子灰葡萄孢菌株生長(zhǎng)速率

參照前人劃分菌落標(biāo)準(zhǔn)[14]，將15個(gè)菌株在PDA上20 ℃培養(yǎng)30 d，其菌落主要存在4種形態(tài)(圖3)。菌絲型，不形成菌核，氣生菌絲茂盛，產(chǎn)孢量極少，菌株QZBC3、8、6、7、9、14和15屬于這種類(lèi)型，如圖3-a所示。孢子型，每皿菌核少于10粒，其生菌絲茂盛，產(chǎn)孢量極大。菌株QZBC10、11、12、13屬于孢子型，如圖3-b所示。細(xì)小菌核型，菌核極小，數(shù)目極多，分散分布，產(chǎn)孢較多，如圖3-c 所示，菌株QZBC1、2、5屬于此類(lèi)型。大菌核型，菌核鼠糞狀且數(shù)目多，呈圓形規(guī)則分布于培養(yǎng)皿中，菌絲和產(chǎn)孢量較少，QZBC4屬于此類(lèi)型，如圖3-d所示。產(chǎn)菌核的菌株，繼續(xù)培養(yǎng)可在菌核上萌發(fā)產(chǎn)生菌絲和孢子。

圖3 菌落菌核形態(tài)及分生孢子產(chǎn)量情況

2.3 RAPD分析

從18條隨機(jī)引物中篩選出4條引物，這4條隨機(jī)引物的擴(kuò)增條帶均在3條以上，具有很高的重復(fù)性，且清晰度高(表2)。將篩選出的4條隨機(jī)引物分別對(duì)15個(gè)茄子灰霉病菌菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果顯示片段長(zhǎng)度范圍在175～2 000 bp，產(chǎn)生的總條帶數(shù)為30條，其中擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)為22條，多態(tài)性比率為73.3%。4條隨機(jī)引物分別擴(kuò)增的總的條帶數(shù)中，總條帶數(shù)最多的引物為S7，擴(kuò)增出11條，最少的引物為S8，擴(kuò)增出5條，平均每條隨機(jī)引物擴(kuò)增的總的條帶數(shù)為7.5條。

2.4 遺傳多樣性分析

將整理好的矩陣圖使用POPGEN軟件計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)，得出觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)為2.0000，有效等位基因數(shù)(Ne)的最高值為1.9912，最低值為1.0000，平均值為1.3708，基因多樣性指數(shù)(H)最高值為0.4978，最低值為0.0000，平均值為0.2352，Shannon指數(shù)(I)最高值為0.6909，最低值為0.0000，平均值為0.3709，其中在S7、S8、OPF-01和OPF-04這4條引物中，Ne值、H值、I值最高的引物是S7和S8，值最低的引物是OPF-01(表3)，遺傳多樣性較為豐富。

表2 篩選出的4條RAPD引物及擴(kuò)增結(jié)果

表3 4條RAPD引物的遺傳多樣性參數(shù)

由圖4可以看出，在相似數(shù)0.76處，15個(gè)茄子灰葡萄孢菌株被劃成4個(gè)類(lèi)群。其中Ⅰ類(lèi)群有3個(gè)，為菌株QZBC1、2和5。該類(lèi)型菌株均能產(chǎn)生細(xì)小菌核。Ⅱ類(lèi)群有5個(gè)菌株有劃為2個(gè)類(lèi)群，即包括孢子型菌株QZBC10、11、12和13，還包括能產(chǎn)生菌核的菌株 QZBC4。Ⅲ類(lèi)群有3個(gè)菌株，為QZBC3、8和9；Ⅳ類(lèi)群有4個(gè)菌株，為QZBC6、7、14和15，這2個(gè)類(lèi)群的菌株均為菌絲型。

圖4 15個(gè)茄子灰葡萄孢菌株聚類(lèi)分析圖

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)15株茄子灰霉病原菌遺傳多樣性進(jìn)行分析，首先利用ITS引物和灰葡萄孢特異引物確定了這些菌株均為B.cinerea，然后對(duì)參試菌株的生長(zhǎng)速率、菌落形態(tài)、菌核形成分布和產(chǎn)孢情況進(jìn)行分析，并利用RAPD分子標(biāo)記進(jìn)一步分析了遺傳多樣性。15個(gè)茄子灰葡萄孢菌株表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性。

經(jīng)過(guò)ITS引物和灰葡萄孢特異引物擴(kuò)增，明確了茄子灰霉病菌均為B.cinerea，說(shuō)明運(yùn)城茄子灰霉病菌優(yōu)勢(shì)種為B.cinerea。其他學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，作物灰霉病病原除了B.cinerea外，還有B.sinoviticola和B.pelargonii等[19，20]。生長(zhǎng)速率測(cè)定顯示15個(gè)菌株的生長(zhǎng)速率存在明顯差異，這與前人研究結(jié)果一致[19]。張佳[14]對(duì)我國(guó)草莓灰霉病研究中發(fā)現(xiàn)，不同灰葡萄孢菌株的菌落和菌核各異，并根據(jù)產(chǎn)孢量、菌絲疏密情況和菌核數(shù)量分布，將菌落分為3大類(lèi)型即菌絲型、孢子型和菌核型，將菌核型又細(xì)分為5種類(lèi)型。本研究中15個(gè)菌株的菌落類(lèi)型均在上述范圍之中，以菌絲型為主有7個(gè)菌株，孢子型和菌核型各有4個(gè)，其中大菌核型有1個(gè)，小菌核3個(gè)。后續(xù)還需要對(duì)更多灰葡萄孢菌株進(jìn)行分析以明確茄子灰霉病菌菌落特征的多樣性。

張蕊等[16]利用RAPD法分析了Amphobotrysricihi的種內(nèi)多樣性，從50條引物里篩選出8條引物，試驗(yàn)結(jié)果顯示種內(nèi)菌株存在明顯的遺傳多樣性。Kandan等[21]采用RAPD標(biāo)記從50條引物里篩選出10條引物分析高粱靶斑病菌多樣性。本研究利用RAPD法從18條隨機(jī)引物里，篩選出4條引物，可用于后續(xù)茄子灰霉病菌多樣性分析。本研究中15個(gè)菌株劃分為4個(gè)類(lèi)群，并且類(lèi)群劃分與菌落形態(tài)有相關(guān)性，說(shuō)明表型多樣性與遺傳多態(tài)性相統(tǒng)一，同時(shí)也證明了同一寄主的灰葡萄菌株間存在明顯的遺傳分化。范詠梅等[18]利用RAPD法對(duì)新疆的灰葡萄多態(tài)性進(jìn)行分析，12個(gè)菌株被劃為4個(gè)類(lèi)群，證明了灰霉菌株間存在遺傳分化，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，運(yùn)城茄子灰霉病菌優(yōu)勢(shì)種為B.cinerea，種內(nèi)存在形態(tài)多樣性。后續(xù)研究將對(duì)灰霉菌株的毒力和抗性差異進(jìn)行分析。研究結(jié)果可為灰霉病的防控提供理論依據(jù)。