孟曉林，丁辰龍，明紅，單金峰，吳春，聶國興*

(1.河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 宿遷農(nóng)科所，江蘇 宿遷 223800；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院合成生物學(xué)醫(yī)藥研究所，河南 新鄉(xiāng) 453003)

近年來，土壤微生物多樣性研究已成為生物多樣性研究的重要領(lǐng)域[1]。有研究顯示，普通土壤中每克包含至少1010個(gè)細(xì)菌[2]，物種接近6 000～50 000個(gè)[3，4]。而在有機(jī)質(zhì)土壤中存在的生物種類、數(shù)量更是驚人，其中細(xì)菌數(shù)量每克包含1012個(gè)，原生動物數(shù)量每克包含104個(gè)，線蟲數(shù)量每克包含104個(gè)[5]。因此，土壤中含有大量的微生物物種多樣性及豐富度信息，其群落構(gòu)成、生物量變化情況及所含酶活性是評價(jià)土壤生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)、系統(tǒng)管理及健康狀況的關(guān)鍵指標(biāo)[6]。其中，以基因、物種、種群和群落作為評價(jià)土壤微生物多樣性的4個(gè)不同層面[7]。

國內(nèi)外研究表明，植物根際與根系土壤微生物的生命活動對土壤形狀、植物對養(yǎng)分的利用與吸收、植物的生長都有明顯影響[8]，根際土壤微生物類群與植物的健康狀況也有一定的關(guān)系[9]。根際土壤微生物在調(diào)解土壤肥力、改善生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)植物根系生長和防治植物病蟲害等方面均有一定的作用[10～14]。通過從根際環(huán)境樣品中篩選具有抗菌、抑菌和降解作用的有益菌來改善生態(tài)環(huán)境，日益為人們所重視。丁浩等[15]以人工蘆葦濕地為研究對象，對不同時(shí)期濕地蘆葦根際及非根際微生物群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌群的變化進(jìn)行了研究，結(jié)果表明蘆葦濕地根際優(yōu)勢微生物除了芽孢桿菌(Bacillus)之外，還包括假單胞菌(Pseudomonadaceae)、氣單胞菌(Aeromonas)，它們在濕地系統(tǒng)污水處理過程中可能發(fā)揮了重要作用，并以此研發(fā)出一種新型微生物制劑，利用人工接種技術(shù)改善濕地系統(tǒng)中微生物群落特征，增強(qiáng)特定微生物群落降解功能。杜小剛等[16]通過研究不同樹齡刺槐根際微生物多樣性，建議在造林時(shí)采用合適的物種和菌根真菌相結(jié)合，充分發(fā)揮菌根真菌在黃土生態(tài)退化區(qū)植被恢復(fù)中的重要作用。Teixeira等[17]則把目光投向極地環(huán)境，通過研究南極維管植物根際土壤微生物多樣性，以期擴(kuò)大微生物菌種庫(尤其是厭氧菌)，結(jié)合環(huán)境的碳循環(huán)討論分析該地環(huán)境微生物與溫室效應(yīng)及生態(tài)系統(tǒng)功能的相互影響和作用。由此，通過了解不同環(huán)境不同植被下的根際土壤微生物多樣性，對其群落微生物的功能和利用價(jià)值進(jìn)行研究，可深入剖析某一生境存在的生態(tài)問題，著力改善生態(tài)環(huán)境。

下龍灣位于越南東北部廣寧省，屬于群島海灣區(qū)，年平均氣溫20 ℃，平均降水量為2 100 mm，土壤pH為6.0～6.5。該地區(qū)屬于典型的喀斯特地貌，擁有獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)，且存在一些特殊的植被類群，如海岸泥灘，水淹紅樹林，山腳沙灘，山坡石壁植物等。本研究以下龍灣地區(qū)采集的植物根際土壤及沙灘沉積物樣品為研究對象，基于純培養(yǎng)技術(shù)及16SrRNA測序技術(shù)對其中的細(xì)菌和放線菌進(jìn)行分析，旨在對該地區(qū)可培養(yǎng)原核微生物的多樣性進(jìn)行分析評價(jià)，并獲取具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)樣品采集于越南下龍灣地區(qū)，采樣時(shí)間為秋季。根據(jù)地形確定采樣地點(diǎn)，并隨機(jī)采集12個(gè)樣品(表1)，土壤pH為6.0～6.5，標(biāo)記后裝入無菌自封袋中，試驗(yàn)室4 ℃保存待用。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基和純化培養(yǎng)基配方見表2和表3。

表2 分離培養(yǎng)基配方

1.3 分離試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

樣品各稱取3 g，分別倒入三角燒瓶中，加入30 mL無菌水，并放入無菌玻璃珠，180 r·min-1振蕩1 h進(jìn)行富集培養(yǎng)。以移液器吸取1 mL懸液轉(zhuǎn)移至試管中，并加入9 mL無菌水，按此方法稀釋至10-4。

分離培養(yǎng)基的配制：依據(jù)表2分別配制分離培養(yǎng)基，并加入制霉菌素(75 mg·L-1，抑制霉菌)。

表3 純化培養(yǎng)基配方

1.3.2 菌株的分離、純化及保藏

吸取100 mL上述懸液，在不同分離培養(yǎng)基上分別進(jìn)行平板涂布，每個(gè)平板設(shè)2個(gè)生物學(xué)重復(fù)，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)10 d；挑選形狀、顏色或大小各不相同的菌落，轉(zhuǎn)接至純化培養(yǎng)基上，對菌落編號并描述其特征；多次純化直至純化板上長出單一菌落，以斜面和甘油管分別進(jìn)行保藏，斜面置于4 ℃冰箱，甘油管置于-80 ℃超低溫冰箱。

1.3.3 DNA提取及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

樣本基因組DNA提取采用酶解法與SDS-高鹽法。PCR擴(kuò)增引物采用細(xì)菌與放線菌通用引物，上游引物F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，下游引物R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，其中10×buffer 2 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板0.5 μL，dNTP Mixture 1.6 μL，TaKaRa Taq0.1 μL，滅菌離子水補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，參數(shù)為94 ℃變性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，由上海生工生物工程有限公司完成測序。測序序列利用BLAST和EzTaxon Server 2.1軟件進(jìn)行序列比對。以具有不同分類地位的典型菌株基因序列和同源性較高的菌株基因序列為參比，利用Clustal X軟件計(jì)算序列相似性，以MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.4 微生物多樣性指數(shù)計(jì)算[18]

香農(nóng)-威納(Shannon-Wienner)生物多樣性指數(shù)：

辛普森(Simpson)物種多樣性指數(shù)：

馬格列夫(Margalef)物種豐富度指數(shù)：

香農(nóng)(Shannon)物種均勻度指數(shù)：

式中，S表示微生物群落全部物種數(shù)目，Pi表示樣品中屬于第i個(gè)種的個(gè)體比例，N表示樣本中所有個(gè)體的數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落多樣性分析

本試驗(yàn)基于10種分離培養(yǎng)基，共分離得到細(xì)菌和放線菌共499株，依據(jù)菌株的形狀、顏色、透明度、邊緣、凸起、濕潤度等指標(biāo)去重復(fù)后，對其中266株進(jìn)行16S rRNA基因序列測序。

對266株的16S rRNA基因進(jìn)行比對、系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明：下龍灣地區(qū)根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌分布于12個(gè)目，29個(gè)科，54個(gè)屬。其中，多樣性最為豐富的類群為芽孢桿菌目(Bacillales)和放線菌目(Actinomycetales)，分別分離到8個(gè)屬和19個(gè)屬，其次是變形菌門(Proteobacteria)的根瘤菌目(Rhizobiales)和伯克氏菌目(Burkholderiales)，分別分離到6個(gè)屬和7個(gè)屬(見圖1a)。

在測序的266株菌株中，數(shù)量最多的為芽孢桿菌(25株)，為該地區(qū)占據(jù)優(yōu)勢的細(xì)菌微生物類群。其次是鏈霉菌(19株)，為該地區(qū)占據(jù)優(yōu)勢的放線菌微生物類群。此外，分離到杜幹氏屬(Duganella)18株；諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)13株(7個(gè)種)；根瘤菌屬(Rhizobium)12株(9個(gè)種)；節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)11株(8個(gè)種)；分枝桿菌屬(Mycobacterium)11株(7個(gè)種)；假單胞菌屬(Pseudomonas)10株(8個(gè)種)。剩余147株菌隸屬于另外46個(gè)屬(見圖1b)，包括變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)和放線菌門(Actinobacteria)。因此，從菌株的分布情況和數(shù)量分析，該地區(qū)土壤可培養(yǎng)原核微生物優(yōu)勢類群為芽孢桿菌屬、杜幹氏菌屬和鏈霉菌屬。

基于上述測序結(jié)果，對原核微生物多樣性指數(shù)計(jì)算，結(jié)果表明，該地區(qū)多樣性指數(shù)分別為：香農(nóng)-威納生物多樣性指數(shù)H′=6.970；辛普森物種多樣性指數(shù)D=0.987；馬格列夫物種豐富度指數(shù)dMa=27.40；香農(nóng)物種均勻度指數(shù)E=1.384。

圖1 下龍灣可培養(yǎng)細(xì)菌分布

2.2 可純培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌系統(tǒng)進(jìn)化分析

由細(xì)菌和放線菌的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果可知，它們主要屬于放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)3個(gè)門(圖2)，少數(shù)屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)和棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)，隸屬于54個(gè)屬。其中，芽孢菌屬、鏈霉菌屬及杜幹氏菌屬為該地區(qū)土壤微生物優(yōu)勢類群，占測序菌株數(shù)量的9.4%、7.14%和6.77%，其余還包括諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、根瘤菌屬(Rhizobium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、假單胞菌屬，占測序菌株總數(shù)的4.89%、4.51%、4.14%、4.14%和3.76%。而其中鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬、節(jié)桿菌屬和分枝桿菌屬均為放線菌門。在所分離的菌株中，CFH84的16S rRNA基因序列相似性是94.36%，為鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)的候選新屬，CFH 60、CFH 499、CFH 483、CFH 363、CFH 308、CFH 351、CFH 326的16S rRNA基因序列相似性分別是96.8%、96.68%、96.92%、96.46%、96.41%、95.8%、96.16%，為壤霉菌屬(Agromyces)、芽孢桿菌屬、中華單胞菌屬(Sinomonas)和擬無枝酸菌屬(Amycolatopsis)的候選新種。

2.3 不同樣點(diǎn)細(xì)菌和放線菌多樣性分析

由圖3可知，在全部12個(gè)樣點(diǎn)中，樣點(diǎn)2中分離的微生物類群最為豐富，占總數(shù)量的20.64%，樣點(diǎn)5及樣點(diǎn)6所獲分離菌株數(shù)量其次，占總數(shù)的18.24%和16.23%，樣點(diǎn)4及樣點(diǎn)9分離菌株數(shù)量最少，占總數(shù)的0.4%。

2.4 分離培養(yǎng)基對可培養(yǎng)微生物分離的影響

由圖4可以看出，4號、8號培養(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)量最多，分離效果最為理想，所分離菌株占菌株總數(shù)的12.82%、12.02%。10號培養(yǎng)基分離菌株數(shù)次之，占菌株總數(shù)的11.62%。6號培養(yǎng)只分離到占總數(shù)3.81%的菌株。

3 討論

越南下龍灣地區(qū)是喀斯特地形的典型代表。迄今為止，關(guān)于越南土壤微生物多樣性的研究多集中于作物根際、河流沉積物、紅樹林及植物內(nèi)生菌等。本文采取純培養(yǎng)技術(shù)，獲取了豐富的細(xì)菌和放線菌資源，在此基礎(chǔ)上，分析該地區(qū)微生物物種多樣性及群落結(jié)構(gòu)，旨在為該生境下微生物資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。在本研究中，根際土壤常見的芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)均被分離出來，其中最優(yōu)勢類群為芽孢桿菌屬(Bacillus)，它可以合成降解高聚物的胞外酶、抗生素和促進(jìn)植物生長的化合物，在腐生營養(yǎng)環(huán)境中通常為優(yōu)勢屬[19]。此外，假單胞菌屬(Pseudomonadaceae)也有較高的豐度。肖龍敏等對枸杞根際微生物群落多樣性研究結(jié)果顯示，假單胞菌屬、紅環(huán)菌屬(Rhodocyclus)、鏈霉菌屬和分支桿菌屬(Mycobacterium)為優(yōu)勢類群，與本研究結(jié)果類似，但芽孢桿菌屬并非優(yōu)勢類群。分析原因，不同的植被覆蓋類型對根際土壤微生物多樣性影響較大[20]。芽孢桿菌屬和假單胞菌屬均為植物根際土壤典型微生物，在植物分泌物和脫落物產(chǎn)生的生境條件下反應(yīng)迅速，繁殖速度很快[19]。

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的可培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌系統(tǒng)發(fā)育樹

本研究結(jié)果顯示，下龍灣地區(qū)根際土壤微生物的Shannon-Wienner指數(shù)及Shannon物種均勻度指數(shù)相對于其它根際土壤[16,17,21]的均較高，表明該地區(qū)微生物多樣性較高，微生物資源較為豐富。但本研究在不同的12個(gè)采樣點(diǎn)所獲得的微生物組成差異較大，其中樣點(diǎn)2占總分離微生物類群的20.64%，而樣點(diǎn)4及樣點(diǎn)9僅占到總分離微生物類群的0.4%。說明在下龍灣不同的樣品采集點(diǎn)根際微生物組成差異顯著不同。Gelsomino等在不同地理位置的土壤中采集16個(gè)土壤樣本，以DGGE法分析不同生境條件下的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果證明，微生物群落結(jié)構(gòu)在不同的土壤類型中差異較大[22]。唐杰等[23]對若爾蓋高原濕地土壤中微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明不同退化階段的高原濕地土壤中微生物數(shù)量、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性均存在顯著差異。究其原因，不同樣品采集點(diǎn)的地理位置、不同類型的土壤理化性質(zhì)(如養(yǎng)分、通氣、水分、pH等)、地上植被的種類、生長狀況及根系分泌物數(shù)量的變化，均會影響根際微生物群落結(jié)構(gòu)[24]。下龍灣地區(qū)屬于喀斯特地貌的特殊地質(zhì)，其多樣化的生態(tài)系統(tǒng)、獨(dú)有的植被種類、特殊的土壤類型使得該地區(qū)原核微生物存在特有的結(jié)構(gòu)特征。此外，該地區(qū)植物種類繁多，且存在一些特殊的植物群落，如海岸泥灘，山腳沙灘，山坡石壁植物等，都會很大程度上影響其根際土壤原核微生物多樣性。因此，應(yīng)根據(jù)具體情況，綜合分析下龍灣樣點(diǎn)間植物根際微生物類群的差異及其與其它地域根際微生物類群的差異，進(jìn)一步對于這種特殊植被覆蓋下的環(huán)境微生物存在的潛在價(jià)值開展深入研究、評估。

目前關(guān)于根際土壤微生物的研究主要集中在其功能和利用上。丁浩[15]和吳林坤[25]等人研究發(fā)現(xiàn)根際土壤優(yōu)勢微生物除了芽孢桿菌之外，還包括假單胞菌、氣單胞菌，以此研發(fā)的新型微生物制劑，不僅可以顯著改善濕地系統(tǒng)中微生物特征，增強(qiáng)微生物降解功能，也為提高作物的產(chǎn)量、質(zhì)量和防治病蟲害提供了保障。此外，本研究利用不同類型培養(yǎng)基對下龍灣地區(qū)根際土壤原核微生物多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)根際土壤微生物類群對不同碳、氮源具有選擇性。張超等對黃土高原不同植被類型根際土壤微生物群落功能多樣性研究發(fā)現(xiàn)，不同植被根際土壤微生物碳源代謝特征不同[26]。因此，可根據(jù)下龍灣地區(qū)根際土壤微生物類群碳、氮源代謝特征進(jìn)行植被種類的選擇，或者根據(jù)其現(xiàn)有植被種類，采用人工的方法對其根際土壤理化性質(zhì)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而使特定根際微生物類群選擇性增殖。綜上所述，本研究結(jié)果不僅可為判斷下龍灣地區(qū)土壤質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支撐，而且為采取合理的植被覆蓋模式、土壤經(jīng)營模式，開發(fā)該地區(qū)旅游資源，維護(hù)其生態(tài)平衡奠定基礎(chǔ)。

圖3 下龍灣地區(qū)不同樣點(diǎn)分離菌株的百分比

圖4 不同分離培養(yǎng)基分離下龍灣地區(qū)菌株的百分比