呂鵬 趙歡 石鳳芹 陳信義 侯麗

摘要：目的? 觀察復(fù)方浙貝浸膏（CZBE）聯(lián)合奧沙利鉑（L-OHP）對(duì)人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株HCT116/L-OHP移植瘤小鼠的抑瘤作用，以及對(duì)移植瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白MDR1、MRP1及LRP5表達(dá)的影響。方法? 將人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株HCT116/L-OHP細(xì)胞接種于Balb/C裸鼠右前腋皮下構(gòu)建人結(jié)腸癌耐L-OHP移植瘤模型，成模后按隨機(jī)數(shù)字表法將移植瘤小鼠分成模型組、L-OHP組（L-OHP 3 mg/kg）、CZBE高劑量（CZBE 10 g/kg）聯(lián)合L-OHP組、CZBE中劑量（CZBE 5 g/kg）聯(lián)合L-OHP組、CZBE低劑量（CZBE 2.5 g/kg）聯(lián)合L-OHP組。分組當(dāng)日開始給藥，CZBE灌胃給藥，每日1次;L-OHP腹腔注射，隔日1次。連續(xù)給藥2周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，稱重后完整剝離瘤體并稱瘤質(zhì)量，計(jì)算腫瘤抑制率。將瘤塊組織制成切片，免疫組化檢測(cè)HCT116/L-OHP移植瘤細(xì)胞膜耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果? 各劑量CZBE聯(lián)合L-OHP均可有效抑制HCT116/L-OHP裸鼠移植瘤的增長(zhǎng)。L-OHP組腫瘤抑制率為27.239%，CZBE高劑量聯(lián)合L-OHP組腫瘤抑制率為45.031%，與L-OHP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CZBE中劑量聯(lián)合L-OHP組腫瘤抑制率為37.669%，CZBE低劑量聯(lián)合L-OHP組腫瘤抑制率為32.147%。與模型組比較，L-OHP組移植瘤細(xì)胞MDR1、MRP1、LRP5的IOD/Area值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與模型組及L-OHP組比較，各劑量CZBE聯(lián)合L-OHP組移植瘤細(xì)胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表達(dá)量均不同程度降低，其中，CZBE中、高劑量聯(lián)合L-OHP組移植瘤細(xì)胞MDR1、MRP1蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CZBE高劑量聯(lián)合L-OHP組移植瘤細(xì)胞LRP5蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? CZBE聯(lián)合L-OHP可提高人結(jié)腸癌耐L-OHP細(xì)胞株移植瘤的腫瘤抑制率，其機(jī)制可能是通過減少人結(jié)腸癌耐L-OHP細(xì)胞膜耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)，增加結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，從而起到協(xié)同增效作用。

關(guān)鍵詞：復(fù)發(fā)浙貝浸膏;結(jié)腸癌;細(xì)胞增殖;多藥耐藥

中圖分類號(hào)：R285.5? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1005-5304（2020）02-0043-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201907434

Effects of Compound Zhebei Extract Combined with Oxaliplatin on Oxaliplatin-resistant Human Colon Cancer Cells and the Expression of Drug Resistance-related Proteins

LYU Peng， ZHAO Huan， SHI Fengqin， CHEN Xinyi， HOU Li

Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China

Abstract： Objective To observe the anti-tumor effect of compound Zhebei Extract （CZBE） combined with oxaliplatin （L-OHP） on human colon cancer cell line HCT116/L-OHP transplanted tumor in mice， and its effects on the expressions of MDR1， MRP1 and LRP5 in transplanted tumor cells. Methods Human colon cancer L-OHP-resistant transplanted tumor model was established by inoculating human colon cancer Oxaliplatin-resistant cells （HCT116/L-OHP） under the right anterior axillary skin of Balb/C nude mice. After the successful establishment of the model， the transplanted mice were divided into five groups according to random number table method： model group， L-OHP group （3 mg/kg L-OHP）， CZBE high-dosage （10 g/kg） combined with L-OHP group， CZBE medium-dosage （5 g/kg） combined with L-OHP group， CZBE low-dosage （2.5 g/kg） combined with L-OHP group. Medication was conducted once the groups were divided. CZBE was given through gavage， once a day; L-OHP was?injected intraperitoneally once every other day for 2 weeks. At the end of the experiment， mice were executed， weighed， and the tumors were removed completely， and the tumor inhibition rate was calculated. Tumor tissue was sliced. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of drug resistance-related proteins in HCT116/L-OHP transplanted tumor cells. Results CZBE combined with L-OHP could effectively inhibit the growth of HCT116/L-OHP xenografts in nude mice. The tumor inhibition rate of L-OHP group was 27.239%， and that of CZBE high-dosage combined with L-OHP group was 45.031%， which was significantly different from L-OHP group （P<0.05）. The tumor inhibition rate of CZBE medium-dosage combined with L-OHP group was 37.669%， that of CZBE low-dosage combined with L-OHP group was 32.147%. Compared with the model group， there was no statistical significance in the IOD/Area values of MDR1， MRP1 and LRP5 in L-OHP group （P>0.05）. Compared with model group and L-OHP group， the IOD/Area values of MDR1， MRP1 and LRP5 of transplanted tumor cells in each dosage combination group decreased in varying degrees. The IOD/Area values of MDR1 and MRP1 in the medium- and high-dosage combination groups decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）， while the IOD/Area values of LRP5 in the high-dosage combination group decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion CZBE combined with L-OHP can improve the tumor inhibition rate of transplanted human colon cancer L-OHP resistant cell lines. The mechanism may achieve synergistic effect by reducing the expression of L-OHP cell membrane resistance-related proteins in human colon cancer and increasing the sensitivity of colon cancer cells to chemotherapeutic medicine.

Keywords： Compound Zhebei Extract; colon cancer; cell proliferation; multidrug resistance

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，就診時(shí)多數(shù)已屬中晚期，死亡率較高[1-2]。晚期結(jié)直腸癌術(shù)前同步放化療、新輔助放化療及術(shù)后輔助化療中加用奧沙利鉑可以提高局部緩解率，但由于對(duì)奧沙利鉑耐藥等因素，遠(yuǎn)期預(yù)后改善有限[2-3]。中醫(yī)藥在晚期結(jié)直腸癌圍化療期中具有協(xié)同增效、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[4]。復(fù)方浙貝浸膏（CZBE）是北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院血液腫瘤科根據(jù)晚期惡性腫瘤臨床特點(diǎn)組方，由浙貝母、川芎、漢防己（1∶1∶1）3味中藥組成，方中浙貝母化痰散結(jié)，川芎行氣活血化瘀，漢防己利濕消腫以截生痰之源。課題組前期體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，復(fù)方浙貝藥物血清高、中、低劑量組對(duì)HCT-116細(xì)胞增殖抑制率分別為40.00%、42.37%和29.15%，細(xì)胞凋亡率分別為18.75%、20.00%、15.32%，均高于對(duì)照組（P<0.05），能通過調(diào)節(jié)P53通路抑制HCT-116細(xì)胞增殖、促其凋亡[5]。但CZBE對(duì)結(jié)直腸癌體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制研究尚未開展。本實(shí)驗(yàn)研究通過構(gòu)建人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑小鼠移植瘤模型，從體內(nèi)觀察CZBE對(duì)耐奧沙利鉑結(jié)直腸癌細(xì)胞的抑制作用及細(xì)胞膜耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步豐富CZBE對(duì)結(jié)腸癌的療效及作用機(jī)制。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 藥物

CZBE，棕褐色粉末，藥物密封，避光陰涼處保存，水溶解性好，北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥房提供，批號(hào)17102504P，實(shí)驗(yàn)前用雙蒸水配成混懸液，冰箱冷藏避光保存。注射用奧沙利鉑，凍干型，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格100 mg/瓶，類白色疏松狀粉末，批號(hào)170809AG。用無菌5%葡萄糖注射液稀釋至使用濃度。

1.2? 細(xì)胞株及動(dòng)物

人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株HCT116/L-OHP，中國中醫(yī)科學(xué)院常規(guī)保存。雄性Balb/C裸鼠，15～17 g，SPF級(jí)，斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（京）2014-0003，實(shí)驗(yàn)全過程在具屏障系統(tǒng)動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)完成，動(dòng)物飼養(yǎng)室實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)SYXK（京）2002-0016。飼養(yǎng)室溫20～25 ℃、日溫差≤3 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照12 h明暗交替，空氣潔凈度為100級(jí)，氨濃度≤14 mg/m3，噪聲≤60 db，工作照度為150～300 L，動(dòng)物照度為100～200 Lx。鼠食用滅菌鼠飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司。小鼠自由飲用過濾消毒水。

1.3? 主要試劑與儀器

0.9%氯化鈉注射液，華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)F201611075;無水乙醇（分析純），北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司，批號(hào)20170727;5%葡萄糖注射液，華潤雙鶴藥液股份有限公司，批號(hào)F201812112。HRP-山羊抗小鼠（Servicebio，貨號(hào)GB23301）。醫(yī)用凈化工作臺(tái)，CJ-2F型，凈化等級(jí)100級(jí)（美國聯(lián)邦標(biāo)準(zhǔn)209E），蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司，librorEB-280型分析天平;82-1型電動(dòng)離心機(jī)，奧豪斯電子精密天平，量程0.01～510 g，美國OHAUS Corp;日本NIKON倒置顯微鏡、Olympus/PM-6顯微鏡;電子數(shù)顯卡尺，桂林廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司，型號(hào)SF2000，分辨率0.01 mm，規(guī)格0～150 mm，標(biāo)準(zhǔn)GB/T14899-94;病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)RM2016;烤片機(jī)，天津天利航空機(jī)電有限公司，型號(hào)KPJ-1A/11030574;攤片機(jī)，浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)KD-P。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 造模

①細(xì)胞培養(yǎng)：HCT116/L-OHP細(xì)胞用10%胎牛血清、1%雙抗RPMI1640完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d換液1次。②接種：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，無血清RPMI1640培養(yǎng)液稀成濃度為6×107個(gè)/mL細(xì)胞懸液，每只鼠右前腋皮下接種6×106個(gè)細(xì)胞，即0.1 mL細(xì)胞懸液。

2.2? 分組和給藥

成瘤后，將移植瘤裸鼠隨機(jī)分為5組，即模型組、L-OHP組（3 mg/kg L-OHP腹腔注射，隔日1次）、CZBE高劑量聯(lián)合L-OHP組（CZBE 10 g/kg灌胃，每日1次;L-OHP 3 mg/kg腹腔注射，隔日1次）、CZBE中劑量聯(lián)合L-OHP組（CZBE 5 g/kg灌胃，每日1次;L-OHP 3 mg/kg腹腔注射，隔日1次）、CZBE低劑量聯(lián)合L-OHP組（CZBE 2.5 g/kg灌胃，每日1次;L-OHP 3 mg/kg腹腔注射，隔日1次），每組10只。連續(xù)給藥2周。實(shí)驗(yàn)開始后每3 d用卡尺測(cè)皮下瘤長(zhǎng)徑和短徑。

2.3? 瘤質(zhì)量及腫瘤抑制率

末次給藥后約6 h，頸椎脫臼法處死小鼠，稱體質(zhì)量后完整剝離小鼠移植瘤組織，測(cè)量各組小鼠腫瘤體積并稱重，根據(jù)瘤質(zhì)量計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=[1-（實(shí)驗(yàn)組瘤質(zhì)量÷模型組瘤質(zhì)量）]×100%。

2.4? 多藥耐藥相關(guān)酶檢測(cè)

免疫組化檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織細(xì)胞MDR1、MRP1、LRP5表達(dá)，步驟：①將各實(shí)驗(yàn)組瘤塊組織進(jìn)行石蠟包埋，脫蠟脫水，采用免疫組化SP二步法（嚴(yán)格按試劑盒說明書操作），抗原熱修復(fù)3 min，切片浸入0.01 mol/L PBS洗滌3次×2 min，滴加3%H2O2，10～15 min，0.01mol/L PBS洗滌3次×2 min，滴加一抗，37 ℃濕盒孵育90 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次×2 min，滴加二抗（生物素標(biāo)記辣根過氧化物酶標(biāo)記抗鼠IgG抗體），37 ℃濕盒孵育90 min。0.01 mol/L PBS洗滌3次×2 min，DBA顯色劑顯色15 min，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照;②TopⅡ和GST判定標(biāo)準(zhǔn)：TopⅡ及GST染色陽性物質(zhì)主要定位于細(xì)胞漿及細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，應(yīng)用Image ProlPus 7.0免疫組化彩色圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，以對(duì)照組陽性點(diǎn)為基礎(chǔ)，對(duì)視野統(tǒng)一測(cè)定參數(shù)，分析實(shí)驗(yàn)各組圖片陽性點(diǎn)積分光密度與細(xì)胞分布區(qū)域面積之比（IOD/Area）反映免疫組化圖片中目標(biāo)蛋白平均表達(dá)量。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0和Grapad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤質(zhì)量及腫瘤抑制率比較

實(shí)驗(yàn)過程中各組小鼠皮下移植瘤持續(xù)增長(zhǎng)，其中模型組小鼠瘤體積生長(zhǎng)最快，其他依次為L(zhǎng)-OHP組、CZBE低劑量聯(lián)合L-OHP組、CZBE中劑量聯(lián)合L-OHP組、CZBE高劑量聯(lián)合L-OHP組。CZBE聯(lián)合L-OHP對(duì)人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株具有顯著抑制作用。CZBE高劑量聯(lián)合L-OHP組腫瘤抑制率為45.03%，與陽性藥L-OHP組比較差異顯著（P<0.05），CZBE中劑量聯(lián)合L-OHP組腫瘤抑制率為37.67%，CZBE低劑量聯(lián)合L-OHP組腫瘤抑制率為32.15%，L-OHP組腫瘤抑制率為27.24%，見表1。

4.2? 免疫組織化檢測(cè)結(jié)果

標(biāo)記的MDR1、MRP1、LRP5呈棕黃色，主要存在于細(xì)胞漿及細(xì)胞膜中。顯微鏡放大400倍顯示，模型組及L-OHP組可見較多的MDR1、MRP1、LRP5表達(dá)細(xì)胞，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。CZBE各劑量聯(lián)合L-OHP組移植瘤細(xì)胞MDR1、MRP1、LRP5表達(dá)減少;其中，與模型組及L-OHP組比較，CZBE中、高劑量聯(lián)合L-OHP組移植瘤細(xì)胞MDR1、MRP1表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CZBE高劑量聯(lián)合L-OHP組移植瘤細(xì)胞LRP5表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見圖1～圖3。

4.3? 復(fù)方浙貝浸膏聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)移植瘤細(xì)胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表達(dá)的影響

與模型組比較，L-OHP組移植瘤細(xì)胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與模型組、L-OHP組比較，CZBE各劑量聯(lián)合L-OHP組移植瘤細(xì)胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表達(dá)降低，CZBE中、高劑量聯(lián)合L-OHP組移植瘤細(xì)胞MDR1、MRP1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CZBE高劑量聯(lián)合L-OHP組移植瘤細(xì)胞LRP5蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

5? 討論

多藥耐藥性是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種化學(xué)治療藥物產(chǎn)生耐藥后，對(duì)未經(jīng)接觸的、結(jié)構(gòu)和功能各異的多種抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象，是目前阻礙化學(xué)治療實(shí)施、影響聯(lián)合化學(xué)治療效果的一大障礙。多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）家族由MRP1～MRP9共9個(gè)成員組成，可通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)多種抗腫瘤藥物，從而限制腫瘤藥物進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。在結(jié)腸癌組織中，其表達(dá)與MDR1、LRP5表達(dá)呈顯著正相關(guān)，MDR1、MRP1、LRP5的高表達(dá)是結(jié)腸癌臨床緩解率低、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，降低MDR1、MRP1、LRP5的表達(dá)逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌多藥耐藥[6-8]。

中醫(yī)藥在晚期惡性腫瘤的多學(xué)科綜合治療模式中具有增效減毒的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，腫瘤積聚及多藥耐藥的難治特點(diǎn)符合中醫(yī)“頑痰”反復(fù)難治的特征[9]，《靈樞·百病始生》“凝血蘊(yùn)裹而不散，津液澀滲，著而不去，而積皆成矣”奠定了血瘀津停、痰瘀互結(jié)腫瘤病機(jī)的基礎(chǔ)。痰瘀作為臨床常見的致病因素和病理產(chǎn)物，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，化痰祛瘀法為中醫(yī)防治腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的常用治療法則[10-12]。CZBE方中浙貝母化痰散結(jié)，川芎行氣活血化瘀，漢防己利濕消腫以截生痰之源，共奏活血化痰散結(jié)之效。課題組前期體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，CZBE能抑制人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖、促其凋亡[5]。

本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)究表明，CZBE各劑量聯(lián)合L-OHP均能有效抑制HCT116/L-OHP裸鼠移植瘤體積的增長(zhǎng)。CZBE高劑量聯(lián)合L-OHP組腫瘤抑制率為45.031%，與L-OHP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，L-OHP組移植瘤細(xì)胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與模型組、L-OHP組比較，CZBE各劑量聯(lián)合L-OHP組移植瘤細(xì)胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表達(dá)均降低，CZBE中、高劑量聯(lián)合L-OHP組移植瘤細(xì)胞MDR1、MRP1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CZBE高劑量聯(lián)合L-OHP組移植瘤細(xì)胞LRP5差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。本研究表明，CZBE聯(lián)合L-OHP能有效抑制人耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細(xì)胞株裸鼠移植瘤的增長(zhǎng)，提高抑瘤率，其機(jī)制可能是通過減少移植瘤細(xì)胞膜耐藥相關(guān)蛋白MDR1、MRP1、LRP5的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性，起到協(xié)同增效作用。結(jié)合課題組前期體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，本研究從移植瘤裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)CZBE對(duì)于人耐奧沙利鉑結(jié)腸癌的療效及作用機(jī)制。

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（收稿日期：2019-07-28）

（修回日期：2019-08-18;編輯：華強(qiáng)）

基金項(xiàng)目：北京市科技計(jì)劃“十病十藥”研發(fā)專項(xiàng)（Z151100003815027）

通訊作者：侯麗，E-mail：houli1203@126.com