李賀娟，楊婷婷，朱夢璽，史 浩，林 蜜，梁高峰

食管癌是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率分別排在全球所有惡性腫瘤的第七位和第六位，我國是食管癌的高發(fā)區(qū)，占世界發(fā)病總數(shù)的一半。食管癌的治療主要是手術(shù)切除、化療、放療、綜合治療等[1]，但毒副作用較大且易發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，迫切需要開發(fā)新的治療手段來提高治療效果，延長患者的生存期。近年來生物治療以其生物相容性好、副作用小等優(yōu)勢，越來越受到人們的關(guān)注，且逐漸成為一種新的治療方式。其中，miRNA就是極具潛力的一種。作為一類高度保守的、長18～25個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，miRNA在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)：多種miRNA在腫瘤中異常表達(dá)，這些異常表達(dá)的miRNAs參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展，并在腫瘤的預(yù)后中扮演著重要角色，如kota等發(fā)現(xiàn)miR-26a在肝癌中異常低表達(dá)，通過腺相關(guān)病毒遞送miR-26a恢復(fù)miR-26a的表達(dá)，有效地抑制了小鼠肝癌的生長[3]。作者通過PLGA納米載體遞送miR-145，在結(jié)腸癌小鼠腫瘤模型中起到明顯的抑瘤效果。miR-145在包括胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、肺癌等多種腫瘤中異常低表達(dá)，通過與多個靶基因c-Myc[4]、FSCN1[5]、SMAD5[6]等作用，抑制腫瘤細(xì)胞生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，通過恢復(fù)腫瘤抑制性miRNA的表達(dá)有望成為一種新的、有潛力的治療手段。

然而，安全、高效地將有治療功能的小分子(細(xì)胞因子、基因、疫苗、抗體等)遞送到腫瘤細(xì)胞一直是亟待解決的問題[7]。血小板膜表面受體可以與腫瘤細(xì)胞相互作用，對腫瘤細(xì)胞具有天然的靶向親和力[8]，因此可以利用這一特性將血小板制備成一種新型的靶向遞送載體，用于對疾病進(jìn)行靶向成像或藥物遞送[9]。同時，將血小板制成納米級血小板，使其更加容易被靶細(xì)胞所內(nèi)吞，從而達(dá)到靶向遞送藥物至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而實現(xiàn)殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[8]。本研究構(gòu)建加載miR-145的納米血小板靶向載藥遞送系統(tǒng)，通過體外實驗研究其對食管癌細(xì)胞增殖、遷移的影響，并進(jìn)一步探討其初步的作用機(jī)制，為食管癌的靶向治療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑2-Iminothiolane hydrochloride (Traut’s Reagent) (產(chǎn)品貨號：I6256)， 3-Maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester(MBS) (產(chǎn)品貨號：M2786)，購自Sigma-Aldrich有限公司；DMSO(產(chǎn)品貨號：D103273)，購自上海阿拉丁生化科技有限公司；食管癌細(xì)胞株KYSE150來自本實驗室；RPMI 1640(貨號：350006CL)購自南京維森特生物技術(shù)有限公司；胎牛血清(貨號：11011-8611)購自浙江天杭生物科技有限公司；青霉素/鏈霉素(產(chǎn)品貨號：P113150)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MTT(產(chǎn)品貨號：M8180)，購自北京索萊寶生物科技有限公司；AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒(貨號：E606336)、Myc抗體、IgG二抗購自上海生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、PCR中所需試劑購自Takara公司；其余試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。所有實驗在相同條件下重復(fù)3次。

1.2 加載miR-145的納米血小板的制備選用加入肝素的新鮮血液，在室溫條件下用臺式低速離心機(jī)進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速1 700 r·min-1離心12 min后得到血小板富集的血漿(PRP)，加入20 μL低濃度阿司匹林水溶液抗血小板聚集。再以3 600 r·min-1離心12 min，吸出上清，得到血小板沉淀，用無菌PBS 洗滌并重懸，顯微鏡下觀察獲得的洗滌血小板(platelet,P)。然后用超聲細(xì)胞破碎儀將血小板制成納米級血小板(Nanoplatelet,NP)，用馬爾文納米粒徑儀(Malvern nanoparticle caliper，MNC)檢測納米血小板的粒徑分布，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化超聲條件得到理想納米血小板的粒徑。

用新鮮配制的碳酸鹽緩沖液配制miR-145的碳酸鹽溶液，使其濃度為1 mg·mL-1；取已配好的1 mg·mL-1FITC/DMSO 100 μL，用移液器每次取10 μL，緩慢地加入2 mL miR-145溶液中，同時注意避光，攪拌、充分混合后，4 ℃避光反應(yīng)8 h；加NH4Cl終止反應(yīng)使其終濃度為50 mM，混合，然后在4 ℃冰箱孵育2 h，獲得FITC標(biāo)記的miR-145 (miR-145/FITC)。取500 μL miR-145/FITC溶液加入5 mL終濃度為200 μM 的MBS溶液，室溫下反應(yīng)30 min，得到帶有馬來酰胺鍵的miR-145/FITC。取100 μL NP懸液與2 μL濃度為250 mmol·L-1(1 000×)的Traut’s Reagent試劑室溫下反應(yīng)30 min，在NP細(xì)胞膜上形成巰基。然后將100 μL含巰基的NP與100 μL帶有馬來酰胺鍵的miR-145/FITC在PBS中混合，室溫孵育15 min，800 g離心10 min，用PBS洗沉淀3次，在PBS中重懸得NP-miR-145。新構(gòu)建的納米血小板載體在PBS中穩(wěn)定保存，在4 ℃最多保存7 d，熒光顯微鏡下觀察納米血小板載體。同法制備P-miR-145。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染將KYSE150細(xì)胞(約1×106細(xì)胞/孔)均勻接種于6孔板中，在10% FBS和0.1%雙抗(100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，實驗分4組：NP-miR-145組、P-miR-145組、miR-145組和空白對照組，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右(約鋪板24 h 后) 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，后續(xù)進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

1.4 RT-PCR法檢測細(xì)胞中miR-145的表達(dá)將6孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染24 h后的KYSE150細(xì)胞用PBS清洗2次，按照Trizol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞的總RNA，測定RNA濃度；再按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并測cDNA濃度；最后根據(jù)RT-PCR試劑盒，將20 μL的反應(yīng)體系加入8聯(lián)管中，進(jìn)行RT-PCR，檢測NP-miR-145、P-miR-145、miR-145和空白對照組中miR-145的表達(dá)。U6作為內(nèi)參，每個實驗均重復(fù)3次。miR-145和U6引物見表1。

表1 RT-PCR實驗引物

1.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力將6孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染6 h后的KYSE150細(xì)胞用10 μL無菌槍頭在6孔板內(nèi)以“一”劃線；用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞2～3遍，以去除懸浮細(xì)胞；然后加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。以劃痕時刻為起始點，分別于0、24、48 h在倒置熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及劃痕愈合情況，拍攝各組細(xì)胞圖片保存，并通過測量劃痕間距離變化來評估其遷移運(yùn)動能力。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡將生長狀態(tài)穩(wěn)定的KYSE150細(xì)胞(5×105細(xì)胞/孔)接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長至約70%匯合度時，在相同的條件下，處理組分別加入200 μL的NP-miR-145、P-miR-145、miR-145，空白對照組加200 μL的細(xì)胞培養(yǎng)液；孵育48 h后，經(jīng)胰酶消化，2 000 r·min-1離心5 min，棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷無菌PBS洗滌細(xì)胞兩次；取400 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，使其密度約為1×106cells·mL-1；在400 μL細(xì)胞懸液中，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于4 ℃避光條件下孵育5 min。再加入10 μL PI，輕輕混勻后于4 ℃避光條件下孵育10 min；用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析，每個實驗均重復(fù)3次。

1.8 Western blot法檢測KYSE150細(xì)胞中Myc蛋白的表達(dá)水平用PBS清洗轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞，冰浴20 min后收集裂解上清，測定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST洗滌，室溫封閉1 h，一抗(1∶1 000稀釋)孵育4 ℃過夜，TBST洗滌4次，二抗孵育2 h，TBST洗滌 4 次后，ECL化學(xué)發(fā)光及顯影。

2 結(jié)果

2.1 載藥遞送系統(tǒng)的表征納米血小板遞送系統(tǒng)見圖1A。圖1B1是納米粒徑儀測試結(jié)果，表明：提取的血小板粒徑約為1 μm左右，分布比較均勻，與血小板相比，納米血小板粒徑明顯較小，該方法可制備大量納米血小板。通過多次優(yōu)化實驗條件發(fā)現(xiàn)：70% amplitude，15 min間隔超聲條件下能夠獲得粒徑在184 nm左右、比較均一、穩(wěn)定的納米血小板(圖1B2)。熒光顯微鏡對納米血小板遞送系統(tǒng)進(jìn)行觀察(圖1C)，圖中看到CY3紅色熒光標(biāo)記的納米血小板和FITC綠色熒光標(biāo)記的miR-145，在同一位置疊加后的圖像呈現(xiàn)明顯的黃色熒光，表明血小板和納米血小板與miR-145成功偶聯(lián)。

A：納米血小板遞送系統(tǒng)的示意圖；B：納米粒徑儀測試結(jié)果：B1為血小板，B2為納米血小板；C：熒光顯微鏡對納米血小板遞送系統(tǒng)進(jìn)行觀察。圖1 納米血小板載藥示意圖及表征

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞內(nèi)miR-145的表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果發(fā)現(xiàn)：12 h時，通過熒光顯微鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)：未處理的空白對照組和單獨的miR-145組未觀察到熒光，在P-miR-145和NP-miR-145組均可檢測到綠色熒光，說明血小板和納米血小板均能攜帶miR-145進(jìn)入細(xì)胞，但NP-miR-145處理組的熒光強(qiáng)度明顯高于P-miR-145處理組(見圖2 )。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，NP-miR-145、P-miR-145、miR-145這3組細(xì)胞中miR-145表達(dá)水平均有所提高，且以NP-miR-145組中miR-145表達(dá)水平為最高。見圖3。

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染12 h的熒光圖

①P<0.05；②P<0.01。圖3 RT-PCR檢測KYSE150細(xì)胞中miR-145的表達(dá)

2.3 各組細(xì)胞遷移情況 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果表明：處理24 h后，NP-miR-145、P-miR-145、miR-145和空白對照組細(xì)胞劃痕明顯存在，但NP-miR-145、P-miR-145組細(xì)胞遷移變慢；48 h后，NP-miR-145、P-miR-145組處理的細(xì)胞劃痕仍然明顯存在，而未處理組和單獨miR-145處理組的劃痕間隙幾乎完全愈合。與空白對照組相比，NP-miR-145、P-miR-145、miR-145這3組細(xì)胞劃痕距離有明顯差異(P<0.01)，表明負(fù)載miR-145的納米血小板能有效抑制KYSE150細(xì)胞的遷移。見圖4。

圖4 KYSE150細(xì)胞遷移實驗

2.4 各組細(xì)胞增殖情況 MTT法檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后12、24 h，NP-miR-145、P-miR-145、miR-145這3組細(xì)胞的吸光度與同時段空白對照組細(xì)胞的吸光度值無明顯差別(P>0.05)；轉(zhuǎn)染后48、72、96 h，NP-miR-145、P-miR-145、miR-145這3組細(xì)胞的吸光度值與同時段空白對照組細(xì)胞的吸光度值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明3組均可明顯抑制KYSE150細(xì)胞的增殖，且以NP-miR-145處理組抑制較明顯(P<0.01)。見圖5。

①P<0.05；②P<0.01。圖5 KYSE150細(xì)胞增殖實驗

2.5 各組細(xì)胞凋亡情況 用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組KYSE150細(xì)胞的凋亡情況。處理24 h后，NP-miR-145處理組細(xì)胞總凋亡率高達(dá)19.7%，直方圖顯示不同處理組凋亡細(xì)胞的定量數(shù)據(jù)，在相同miR-145濃度下，NP-miR-145組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他處理組。見圖6。

①P<0.05；②P<0.01。圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測KYSE150細(xì)胞凋亡

2.6 各組細(xì)胞中Myc蛋白的表達(dá)水平根據(jù)miR-145與靶基因的作用原理(圖7A)，作者通過Western blot檢測了Myc在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果見圖7B、7C：空白對照組與單獨的miR-145組Myc的表達(dá)沒有明顯差異；與空白對照組相比，NP-miR-145、P-miR-145兩組細(xì)胞中Myc蛋白都明顯降低，且以NP-miR-145組降低最明顯，以上結(jié)果表明NP-miR-145處理組miR-145抑制靶基因Myc蛋白表達(dá)能力最強(qiáng)。

3 討論

食管癌居世界癌癥死因順序的第六位。全球每年約有45.6萬食管癌新發(fā)病例和40萬死亡病例，我國食管癌發(fā)病率和死亡率均最高[10]。食管癌由于缺乏有效的臨床診斷方法，常在發(fā)病后期被診斷，手術(shù)、放療和化療是其典型的治療方法，但這些治療方法容易發(fā)生局部和(或) 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。因此，尋找食管癌中有預(yù)后價值的生物標(biāo)志物，對于食管癌的治療和預(yù)后評價具有重要意義[11]。此外，20世紀(jì)80年代，美國學(xué)者Oldham提出了生物反應(yīng)調(diào)節(jié)理論，使生物治療成為繼手術(shù)、放療、化療之后的第四大腫瘤治療模式。生物治療因其安全、有效、毒副反應(yīng)低等特點，被認(rèn)為是本世紀(jì)腫瘤綜合治療模式中最活躍、最有前途的手段[7]。

①P<0.05；②P<0.01。圖7 miR-145與靶基因結(jié)合示意圖及Myc蛋白的Western blot檢測

研究證實多種miRNA在腫瘤中異常表達(dá)，這些miRNA通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等扮演著癌基因或腫瘤抑制因子的作用[12]。近年來，人們通過上調(diào)腫瘤中異常低表達(dá)的miRNA或者下調(diào)異常高表達(dá)的miRNA，取得了良好的抑瘤效果。Trang等[13]通過慢病毒顆粒向腫瘤內(nèi)傳遞let-7b，能明顯減小異種移植瘤的體積；Kota等[3]通過腺相關(guān)病毒系統(tǒng)遞送miR-26a，抑制了癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，有效地阻礙了疾病的進(jìn)程。研究表明：miR-145在多種腫瘤中顯著下調(diào)，是一種抑癌基因。早在2003年，Michael等[14]在對結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，有兩個miRNA即miR-143和miR-145，出現(xiàn)明顯下調(diào)。2011年首次報道了miR-145在 ESCC 中表達(dá)下調(diào)[15]。另有研究報道m(xù)iR-145能抑制ESCC中癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞增殖[16]。雖然miR-145是一個在食管癌中有潛在治療價值的腫瘤抑制性miRNA，然而，安全、高效地將miR-145遞送到食管癌細(xì)胞中是一直需要突破的問題。

目前，研究最多的藥物/基因遞送主要有病毒載體和非病毒載體兩大類，病毒載體雖然具有較好的遞送能力，但潛在的致病性和免疫原性極大地限制了其應(yīng)用。非病毒載體包括各種脂質(zhì)體、納米陽離子聚合物、納米膠束等，這些非病毒載體由于良好的遞送能力及較好的生物相容性受到人們的青睞。然而這些人工合成的納米材料在制備過程中不可避免地引入一些有機(jī)或無機(jī)材料，含金屬元素或聚合物的納米粒子的生物降解能力較差，容易滯留在肝腎組織內(nèi)，引起炎癥反應(yīng)和毒性損傷[17]。合成脂質(zhì)體或納米粒子的化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)一般較為簡單，在血液循環(huán)中的半衰期較短，并易引起免疫排斥反應(yīng)[18]。因此，不能很好地實現(xiàn)靶向性。為了解決這些問題，人們逐漸開始將天然細(xì)胞制備成載體(如紅細(xì)胞、經(jīng)基因工程改造的干細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞、血小板)用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的研究[19-20]。

有研究報道用FⅧ凝血因子轉(zhuǎn)染的血小板治療出血性疾病，如血友病，或者用血小板轉(zhuǎn)運(yùn)凝血因子到血栓形成部位釋放出其內(nèi)部裝載的藥物治療血管創(chuàng)傷[21]。還有研究利用血小板對腫瘤細(xì)胞的天然靶向性裝載抗腫瘤藥物阿霉素進(jìn)行抗腫瘤治療[22]。與現(xiàn)有研究報道中的血小板載體相比[19-22]，本研究將血小板經(jīng)溫和超聲獲得納米級別的血小板，保留了血小板的載藥能力和在膜表面連接外源性蛋白的能力，同時因為體積較小，能夠被靶細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[23]，并且加入阿司匹林可有效抑制納米血小板的聚集，從而高效地靶向KYSE150細(xì)胞。

本研究結(jié)果顯示，納米血小板加載miR-145后對KYSE150細(xì)胞能夠較強(qiáng)地抑制其增殖、遷移，促進(jìn)其凋亡，并且能顯著地下調(diào)Myc癌基因表達(dá)。Myc是哺乳動物種屬中最為重要的一類癌基因，在多種腫瘤中都有Myc基因的擴(kuò)增或過度表達(dá)，與食管癌的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵犯深度呈正相關(guān)[24]。miR-145可通過直接靶向Myc抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)凋亡，由此，Myc基因有望成為miR-145治療食管癌的重要靶點之一。此外，本研究表明納米血小板可作為優(yōu)良的載體遞送生物治療藥物，為食管癌基因靶向治療提供新的策略，但進(jìn)一步的體內(nèi)實驗和相關(guān)的分子機(jī)制有待深入研究。