谷變利，王娟萍，孔金玉，劉雅莉，張 灝，詹啟敏，高社干

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)是人類牙周炎重要的致病菌，已有研究表明其在口腔內(nèi)的水平可預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展或活動(dòng)性[1-2]。據(jù)報(bào)道，P.gingivalis與多種人類腫瘤密切相關(guān)，如口腔癌[3]、上消化道癌[4]、胰腺癌[5]等，以及心血管疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茲海默癥等口腔-消化道系統(tǒng)及其他系統(tǒng)性疾病相關(guān)[6-7]。食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是食管癌主要的一個(gè)組織亞型。已報(bào)道P.gingivalis在食管癌組織中的陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織及正常食管黏膜組織，且P.gingivalis與食管癌細(xì)胞分化狀態(tài)、轉(zhuǎn)移以及患者生存率呈正相關(guān)[4]。2017年的研究顯示，P.gingivalis在上消化道各部位腫瘤組織中不均勻分布，從食管到賁門(mén)至胃呈上高下低的趨勢(shì)[8]。這些研究表明，P.gingivalis可能是食管癌的高危因素。河南是中國(guó)食管癌高發(fā)省，為了摸清食管鱗癌高危人群、癌前病變及食管癌患者中P.gingivalis感染的流行病學(xué)特點(diǎn)，大樣本量的流行病學(xué)調(diào)查活動(dòng)勢(shì)在必行。因此，一種能夠簡(jiǎn)便而又準(zhǔn)確地檢測(cè)口腔P.gingivalis感染狀態(tài)的方法顯得十分必要。

目前，檢測(cè)P.gingivalis感染的方法主要有培養(yǎng)法及分子生物學(xué)方法等。培養(yǎng)法結(jié)果具有高度特異性，然而，該法缺乏敏感性，培養(yǎng)成功率低，且需要5～7 d時(shí)間[9]，因此不適于大規(guī)模分子流行病學(xué)篩查。PCR為代表的分子生物學(xué)方法目前已發(fā)展成熟，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法更是廣泛用于定量檢測(cè)唾液、牙菌斑、舌背等新鮮來(lái)源樣本中的P.gingivalisDNA檢測(cè)[10-12]。一般地，大多數(shù)DNA檢測(cè)技術(shù)，需要對(duì)樣本進(jìn)行基因組DNA抽提，或者經(jīng)過(guò)裂解，釋放核酸，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然而，在核酸抽提過(guò)程中，樣本的管間轉(zhuǎn)移步驟容易造成DNA的少量丟失，而影響PCR定量結(jié)果[13]。裂解法釋放基因組DNA相對(duì)試劑盒法步驟簡(jiǎn)便，但涉及加熱離心等多個(gè)步驟，在應(yīng)用于大規(guī)模樣本檢測(cè)時(shí)就顯得操作繁瑣，且耗時(shí)費(fèi)力。因此，本研究采用直接PCR法檢測(cè)100例體檢者口腔P.gingivalis，無(wú)核酸裂解抽提步驟，檢測(cè)的靈敏度與特異性與常用的裂解方法及試劑盒抽提方法對(duì)比驗(yàn)證，探究直接PCR法快速篩查口腔中P.gingivalis的可行性。

直接PCR是一種無(wú)需基因組DNA抽提、純化及定量步驟，直接將樣本加入PCR體系的方法。該方法只需一步操作，可以避免抽提中造成的DNA丟失。直接PCR擴(kuò)增在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用始于20世紀(jì)90年代。直接PCR目前常規(guī)應(yīng)用于臨床樣本病毒和細(xì)菌等病原體的檢測(cè)，以及生物多樣性監(jiān)測(cè)與物種鑒定[14-15]。直接PCR法的優(yōu)勢(shì)在血液[16-17]、頭發(fā)[18]、指紋[19]、織物[20]及“觸摸 DNA(touch DNA)”[14]等類型來(lái)源樣本中已有報(bào)道。然而，直接PCR法用于快速檢測(cè)牙齦拭子中的P.gingivalisDNA卻鮮有報(bào)道。

因此，本研究采用Tris-EDTA緩沖液置換細(xì)胞保存液，不依賴任何核酸裂解液或抽提步驟，直接qPCR檢測(cè)口腔拭子中P.gingivalis16S rRNA編碼基因，以期為P.gingivalis及其他微生物大規(guī)模分子流行病學(xué)研究提供快速有效的篩查手段。

1 材料與方法

1.1 樣本收集2019年10月來(lái)我院體檢中心進(jìn)行體檢的100例成年健康人(男性37例，女性63例)，年齡20～79 (50.8±17.1)歲。樣本排除標(biāo)準(zhǔn)為：①體檢當(dāng)天有刷牙、飲水、進(jìn)食等行為活動(dòng)；②近1 a有牙周或口腔治療史；③近3個(gè)月口服過(guò)抗生素或非甾體類抗炎藥物；④懷孕；⑤牙齒總數(shù)少于20顆(至少有4顆磨牙)。樣本采集信息包括：年齡、性別、吸煙及飲酒狀態(tài)。本研究獲得河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及受試體檢人員的知情同意。

在體檢當(dāng)天，采用iCleanhcy一次性口腔植絨拭子(深圳華晨陽(yáng)科技有限公司)，于受試者口腔4個(gè)象限第二、三磨牙的牙齦處，用刷牙的力度，擦拭并旋轉(zhuǎn)拭子各3次，拭子放入采集管的保存液中，折斷手柄，密封，完成取樣。樣本檢測(cè)前，保存于4 ℃不超過(guò)1周。每人采集雙份拭子。

1.2 拭子處理及核酸裂解、基因組DNA抽提①對(duì)全部拭子統(tǒng)一做以下處理：蓋緊管蓋，漩渦震蕩混勻，將保存液從收集管中轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中(AXYGEN，MCT-150-C)，做好標(biāo)記；常溫下12 000 r·min-1離心10 min；棄上清(盡量棄除干凈)，同時(shí)避免損失沉淀物。②對(duì)其中100份沉淀物的處理：加入Tris-EDTA (10 mM tris,1 m EDTA,pH 8.0) 50 μL，旋渦震蕩，重懸沉淀物，常溫放置，直接用于qPCR。③對(duì)另一組100份中的50份沉淀物的處理：加入細(xì)胞裂解液 (#18LS11001,深圳亞能生物) 50 μL，輕彈或旋渦，以重懸沉淀物，放于金屬恒溫器，100 ℃加熱10 min；常溫下12 000 r·min-1離心10 min，取出靜置，上清用于qPCR。④對(duì)剩余50份沉淀物的處理，按照MicroElute Genomic DNA Kit(#D3096-02,OMEGA)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行離心柱法核酸抽提。最后用30 μL經(jīng)70 ℃預(yù)熱的Elution Buffer洗脫DNA，測(cè)定核酸質(zhì)量與濃度，用于后續(xù)qPCR。

1.3 模擬陽(yáng)性樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品制備取已知P.gingivalis陰性個(gè)體的口腔拭子，經(jīng)離心后(12 000 r·min-1，10 min)去除保存液，得到沉淀物，加入1 mL已知濃度(1×109IU·mL-1)的P.gingivalisATCC 33277菌液(本實(shí)驗(yàn)室復(fù)蘇培養(yǎng))至口腔拭子沉淀物中，重懸沉淀，混勻后12 000 r·min-1，離心10 min，棄凈上清；加入100 μL TE buffer，重懸混勻。按10倍比濃度梯度進(jìn)行稀釋，得到一系列P.gingivalis濃度：107、106、105、104、103、102、101IU·mL-1，測(cè)試qPCR體系靈敏度，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。Ct值 ( cycle threshold value) 用于評(píng)估每個(gè)樣本感染P.gingivalis的量。

1.4 qPCR擴(kuò)增P.gingivalis特異性引物探針序列參考Kuboniwa M的文獻(xiàn)[10]，序列為：P.gingivalisforward,5’-ACCTTACCCGGGATTGAAATG-3’,P.gingivalisreverse,5’-CAACCATGCAGCACCTACATA-GAA-3’;P.gingivalisprobe,5’-FAMATGACTGATGGTGAAAA-CCGTCTTCCCTTC-TARMA-3’。引物和探針序列均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品及受測(cè)樣本進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。PCR體系如下：AceQ PCR Probe Master Mix (Vazyme,Q112-03) 10 μL，10 μmoL正反向引物各0.5 μL，0.2 pmoL TaqMan 探針，2 μL溶解液/裂解的上清/50 ng DNA，補(bǔ)加DEPC水至總體積20 μL。以上體系加入八聯(lián)管，于BioRad CFX96TM實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，按照95 ℃，10 min，40 個(gè)PCR 循環(huán) (95 ℃，10 s； 60 ℃，60 s)的步驟進(jìn)行擴(kuò)增，利用CFX MaestroTM software軟件分析擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 TE-直接qPCR體系靈敏度測(cè)試經(jīng)TE-直接qPCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，在1×107～1×103IU·mL-1濃度區(qū)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，定量方程斜率為-3.521，R2=0.997，擴(kuò)增效率為92.3%。Ct值在18～32(圖1)。故本研究建立的口腔拭子TaqMan 熒光定量PCR體系檢出P.gingivalis的靈敏度達(dá)1 000 IU·mL-1。定性檢測(cè)可判定Ct≥38為陰性，Ct<38為陽(yáng)性。

2.2 TE-直接qPCR、裂解液-直接qPCR、拭子核酸抽提試劑盒-qPCR法檢測(cè)P.gingivalis結(jié)果確定了直接qPCR體系后，對(duì)100例口腔拭子采用TE-直接qPCR法進(jìn)行P.gingivalis檢測(cè)，對(duì)另一組中的50例口腔拭子采用裂解液-直接qPCR檢測(cè)P.gingivalis。對(duì)剩余50例口腔拭子采用試劑盒-qPCR法檢測(cè)P.gingivalis。3種方法檢出P.gingivalis陽(yáng)性率結(jié)果及分析見(jiàn)表1-2。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，TE-直接qPCR法與裂解液-直接qPCR法相比，及TE-直接qPCR法與試劑盒-qPCR法相比，檢出P.gingivalis無(wú)顯著差異(表1-2)。

A：口腔拭子牙齦卟啉單胞菌標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線；B：牙齦卟啉單胞菌標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1 直接PCR體系靈敏度

表1 TE-直接qPCR與裂解法-直接qPCR檢測(cè)P. gingivalis的結(jié)果對(duì)比

注：①χ2=0.045，P=0.832；②針對(duì)PCR陽(yáng)性樣本；③配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P=0.019；④Ct值的配對(duì)樣本t檢驗(yàn),P=0.019。

表2 TE-直接qPCR與核酸抽提試劑盒法-qPCR檢測(cè)P. gingivalis的結(jié)果對(duì)比

注：①χ2>0.999，P=1；②針對(duì)PCR陽(yáng)性樣本；③配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P=0.933；④兩種方法檢測(cè)Ct值的配對(duì)樣本t檢驗(yàn),P=0.907。

2.3 對(duì)比裂解液-直接qPCR檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)TE-直接qPCR法在50例樣本中，裂解液-直接qPCR與TE-直接qPCR法共同檢出P.gingivalis陽(yáng)性16例，陰性33例，一致率達(dá)98.0%；兩種方法在檢測(cè)陽(yáng)性樣本Ct值及定量結(jié)果log10均值方面具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均為P=0.019。參考裂解液-直接qPCR方法，TE-直接qPCR法檢測(cè)P.gingivalis的靈敏度與特異性分別為94.1%和100%，兩種方法在定性檢測(cè)P.gingivalis上具有較高一致性(Kappa=0.954)(表3)。

2.4 對(duì)比試劑盒-qPCR檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)TE-直接qPCR法在50例樣本中，試劑盒-qPCR與TE-直接qPCR兩種方法共同檢出陽(yáng)性23例，陰性27例，檢測(cè)P.gingivalis一致率達(dá)100% ；兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性樣本Ct均值及定量結(jié)果log10均值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.907，P=0.933)。參考試劑盒-qPCR，TE-直接qPCR法檢測(cè)P.gingivalis的靈敏度與特異性均為100%，兩種方法高度一致，Kappa=1(表4)。

表3 對(duì)比裂解法-直接qPCR，TE-直接qPCR檢測(cè)P. gingivalis的性能評(píng)價(jià)

表4 對(duì)比試劑盒法-qPCR，TE-直接qPCR檢測(cè)P. gingivalis的性能評(píng)價(jià)

3 討論

本研究首次采用TE buffer結(jié)合直接qPCR法檢測(cè)口腔中P.gingivalis，其優(yōu)越性在于能直接擴(kuò)增樣本中細(xì)菌DNA，無(wú)需抽提或裂解釋放核酸步驟。據(jù)報(bào)道使用商業(yè)化的核酸抽提試劑盒抽提核酸時(shí)會(huì)丟失模板DNA，影響qPCR檢測(cè)結(jié)果。而采用直接qPCR法，能夠最有效地?cái)U(kuò)增模板，減少出錯(cuò)或污染率。本研究方法為直接qPCR法，每個(gè)反應(yīng)能檢測(cè)低至1 000 IU·mL-1的P.gingivalisDNA，對(duì)比裂解液-直接qPCR，本方法檢測(cè)P.gingivalis的靈敏度和特異性分別達(dá)到94.1%和100%。對(duì)比試劑盒-直接qPCR，本方法檢測(cè)P.gingivalis的靈敏度和特異性均達(dá)到100%，其檢測(cè)性能與兩種參比方法高度一致。此外，從樣本處理到定量PCR檢測(cè)結(jié)束只需1.5 h(裂解液-直接qPCR需2 h，試劑盒-qPCR法則需3.5 h)，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

直接qPCR體系中，最重要的因素是穩(wěn)定且高效的DNA聚合酶系統(tǒng)，可直接用于體液、組織的擴(kuò)增；同時(shí)，達(dá)到對(duì)背景復(fù)雜或者低豐度模板DNA有良好擴(kuò)增效果。TE buffer有保存穩(wěn)定DNA的功能，用它溶解重懸口腔脫落細(xì)胞沉淀物，既不會(huì)影響直接qPCR反應(yīng)，又能在一定程度上起到稀釋口腔雜質(zhì)，穩(wěn)定模板DNA的作用。因此，本研究采用TE buffer重懸樣本，選擇文獻(xiàn)已報(bào)道且廣泛應(yīng)用的P.gingivalisATCC 33277特異引物探針[10]，使用穩(wěn)定高效的AceQ PCR Probe Master Mix建立P.gingivalis的直接qPCR體系。采用陰性口腔拭子樣本，加入已知濃度的P.gingivalisATCC 33277菌液，模擬陽(yáng)性樣本，進(jìn)行定量標(biāo)準(zhǔn)品制備，測(cè)試直接qPCR反應(yīng)體系的靈敏性。結(jié)果表明，該體系在復(fù)雜背景中擴(kuò)增P.gingivalisDNA性能穩(wěn)定且靈敏度高，能實(shí)現(xiàn)模板DNA的定量。因此，使用特異引物探針，采用TE-直接qPCR法快速靈敏地檢測(cè)口腔P.gingivalis應(yīng)用價(jià)值巨大。

在對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，只有1例樣本結(jié)果不一致，即裂解法-直接qPCR檢出陽(yáng)性而TE-直接qPCR檢測(cè)為陰性。作者采用TE-直接qPCR法，對(duì)這1例樣本重復(fù)檢測(cè)2次后，發(fā)現(xiàn)2次結(jié)果重復(fù)性較差(1次弱陽(yáng)性，1次無(wú)擴(kuò)增)?？紤]到樣本為口腔拭子，采用的是免核酸抽提及免裂解步驟的直接qPCR方法檢測(cè)，對(duì)照裂解液-直接qPCR結(jié)果，推測(cè)這例樣本存在較低豐度的P.gingivalis，陰性結(jié)果可能是樣本中潛在的抑制物造成的。另外，TE-直接qPCR法與裂解法-直接qPCR在檢測(cè)P.gingivalis方面具有較好的一致性。但分析表明，這兩種方法在反映定量結(jié)果的Ct均值與log10均值方面，對(duì)比有差異，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。說(shuō)明TE-直接qPCR法與裂解法-直接qPCR在定性檢測(cè)P.gingivalis上高度一致，但用于定量檢測(cè)P.gingivalis時(shí)，二者一致性較差。當(dāng)然，本研究也具有一定的局限性。首先，沒(méi)有深入研究TE buffer的最佳使用體積。研究中，為了保持與裂解液體積一致，采用了50 μL的用量。眾所周知，不同個(gè)體，口腔脫落細(xì)胞的量并不一致，因此，在溶解脫落細(xì)胞沉淀物進(jìn)行直接qPCR時(shí)，必定有最小及最大體積的使用界限。再者，本研究中涉及的樣本數(shù)量比較有限，也未對(duì)口腔中其他常見(jiàn)細(xì)菌，比如具核梭桿菌、產(chǎn)黑普氏菌等一些革蘭氏陽(yáng)性菌等進(jìn)行研究。

綜上所述，本研究首次建立了免核酸抽提的TE-直接qPCR法檢測(cè)口腔P.gingivalisDNA。該方法除了具有高靈敏性與特異性外，還容易操作，整個(gè)過(guò)程只需1.5 h。這一快速準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可用于食管癌分子流行病學(xué)研究，并在大規(guī)模流行病學(xué)篩查方面具有潛在優(yōu)勢(shì)。

(致謝：感謝崔天星、李智濤等人在技術(shù)方面答疑解惑，感謝蘭子君、劉其偉、許海軍等人在樣本收集中提供的幫助！)