陳 超，田翔宇，邱 森，王 潼，韓俊雅，陳奎生

食管癌是一種起源于食管黏膜上皮或食管腺上皮的惡性腫瘤，且經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移多見，主要分為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)兩種亞型，這兩種亞型的發(fā)生、發(fā)展機制和病理特征均不相同。根據(jù)國際癌癥研究署發(fā)表的GLOBOCAN 2018研究顯示[1]，2018年有57.2萬人新診斷為食管癌，同時又有50.9萬人死于食管癌，在所有腫瘤中分別排在第七位和第六位。同時，在食管癌患者中還存在明顯的地域差異，以東亞地區(qū)最為多見，歐美等發(fā)達國家相對較少，而中國是食管癌發(fā)病大國，根據(jù)WHO實時數(shù)據(jù)，我國食管癌患病率和死亡率都排在全球第五位，但因我國龐大的人口基數(shù)，食管癌新發(fā)患者和死亡患者都占全球的55%左右，且以食管鱗狀細胞癌為主[2]。癌相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，其特異性表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)。有大量證據(jù)表明，CAFs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和最終擴散中起著重要作用[3]。對食管鱗狀細胞癌細胞系的體外研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的增殖、血管生成和遷移在很大程度上取決于活化成纖維細胞的存在[4]。本研究采用免疫組織化學法檢測食管鱗狀細胞癌組織中的CAFs的浸潤情況并計算微淋巴管密度(microlymphatic vessel density,MLVD)，探討食管鱗狀細胞癌中CAFs與淋巴轉(zhuǎn)移及淋巴管生成的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料本研究樣本取自河南科技大學第二附屬醫(yī)院2012年5月至2015年5月手術(shù)切除并病理確診的食管鱗狀細胞癌的新鮮組織。選取新鮮無壞死食管鱗狀細胞癌組織53例，正常食管黏膜組織25例(取材距癌灶>5 cm)?；颊呷脒x標準：①病理類型確診為食管鱗狀細胞癌；②手術(shù)前未經(jīng)放療化療及其他治療；③病歷資料完整可靠。臨床分期根據(jù)2017年第八版UICC/AJCC食管癌的TNM分期標準進行評定[5]。D2-40抗體試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔anti-α-SMA單克隆抗體購自美國Abcam公司，兔Streptavidin-HRP試劑盒購自康為世紀，小鼠二步法免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法所有組織樣本均于離體2 h內(nèi)用無菌生理鹽水清洗并用4%多聚甲醛固定，進行石蠟包埋、切片(4 μm)、烤片、脫蠟水化、高壓修復抗原(α-SMA采用檸檬酸鈉緩沖液 pH6.0，D2-40采用EDTA pH 9.0)，嚴格按照試劑盒說明書進行SP法染色，蘇木素復染、脫水透明、中性樹膠封片，室溫下晾曬24 h。顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 CAFs計數(shù)α-SMA陽性表達位于細胞質(zhì)，均呈棕黃色顆粒，陽性細胞即為CAFs。用顯微鏡于低倍鏡(10×10倍)下觀察免疫組織化學染色切片，選取陽性表達細胞的密集區(qū)，即為“熱區(qū)(hot spot)”，再于高倍鏡(40×10倍)下隨機選取5個視野，計數(shù)各個視野中表達 α-SMA的細胞數(shù)，取平均值即為每高倍鏡(high power lens,HP)視野下CAFs數(shù)。

1.3.2 MLVD計數(shù)D2-40陽性表達位于細胞膜，呈棕黃色顆粒，陽性細胞即為淋巴管內(nèi)皮細胞。用顯微鏡于低倍鏡(10×10倍)下觀察免疫組織化學染色切片，選取新生淋巴管密集的區(qū)域，即為“熱區(qū)”，再于高倍鏡(40×10倍)下隨機選取5個視野，計數(shù)各個視野中微淋巴管的數(shù)量，取平均值即為每高倍鏡視野下MLVD。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細胞癌組織及正常食管黏膜組織中CAFs計數(shù)α-SMA作為CAFs的特異性標志物，其陽性表達位于細胞漿，呈棕黃色顆粒，α-SMA的表達情況即可反映CAFs的浸潤情況。結(jié)果顯示：食管鱗狀細胞癌組織中CAFs的浸潤數(shù)量明顯多于正常食管黏膜組織(P<0.05)，CAFs在兩種不同組織中的浸潤情況見表1，在兩種不同組織中的染色情況見圖1。

表1 CAFs在兩種不同組織中的浸潤情況

A：正常食管黏膜組織(SP法，×100)；B：食管鱗狀細胞癌組織(SP法，×100)。圖1 CAFs在兩種不同組織中的浸潤情況

2.2 食管鱗狀細胞癌組織中CAFs的浸潤數(shù)量與食管鱗狀細胞癌患者臨床病理特征的關系食管鱗狀細胞癌組織中CAFs的浸潤數(shù)量明顯多于正常食管黏膜組織，因此，本研究進一步探討在食管鱗狀細胞癌組織中CAFs的浸潤數(shù)量與食管鱗狀細胞癌患者臨床病理特征的關系。表2結(jié)果顯示，CAFs的浸潤數(shù)量與食管鱗狀細胞癌患者的性別、年齡無關(P>0.05)，而與病理分級、浸潤深度以及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(P<0.05)。

表2 食管鱗狀細胞癌組織中CAFs數(shù)量與患者臨床病理特征的關系

2.3 食管鱗狀細胞癌組織及正常食管黏膜組織中D2-40的表達(MLVD)情況D2-40作為淋巴管內(nèi)皮細胞的特異性標志物，其陽性表達位于細胞膜，呈棕黃色顆粒，D2-40的表達情況即可反映淋巴管的生成情況，即微淋巴管密度(MLVD)。結(jié)果顯示：食管鱗狀細胞癌組織中MLVD計數(shù)明顯多于正常食管黏膜組織(P<0.05)，淋巴管在兩種不同組織中的生成情況見表3，在兩種不同組織中的染色情況見圖2。

表3 D2-40在兩種不同組織中的表達情況(MLVD)

A：正常食管黏膜組織(SP法，×100)；B：食管鱗狀細胞癌組織(SP法，×100)。圖2 淋巴管在兩種不同組織中的生成情況

2.4 食管鱗狀細胞癌組織中CAFs數(shù)量與MLVD計數(shù)之間的關系食管鱗狀細胞癌組織中CAFs的浸潤數(shù)量與MLVD計數(shù)均明顯高于正常食管黏膜組織，且對53例食管鱗狀細胞癌組織中CAFs的浸潤數(shù)量與MLVD計數(shù)進行Spearman相關性分析顯示，r值為0.632(P<0.05)，兩項數(shù)值呈正相關。

3 討論

目前食管鱗狀細胞癌分子機制的初步研究主要集中在腫瘤細胞的內(nèi)在特征，即癌基因的激活和抑癌基因的失活。然而，越來越多的證據(jù)表明腫瘤細胞的外在因素，即腫瘤微環(huán)境，也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要組成部分[6-7]。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是腫瘤存在的細胞環(huán)境，包括周圍血管、免疫細胞、成纖維細胞、骨髓來源的炎性細胞、淋巴細胞、信號分子和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)[8]。腫瘤與周圍微環(huán)境密切相關，相互作用不斷。腫瘤可以通過釋放細胞外信號、促進腫瘤血管生成和誘導外周免疫耐受來影響微環(huán)境，而微環(huán)境中的各類間質(zhì)細胞和生物活性物質(zhì)可以影響腫瘤細胞的生長。CAFs是腫瘤微環(huán)境中腫瘤基質(zhì)的主要組成部分，其不僅作為結(jié)構(gòu)骨架為腫瘤細胞提供機械支持，更可以通過旁分泌途徑、外泌體途徑、免疫應答調(diào)節(jié)途徑以及細胞外基質(zhì)重塑等方式促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。本研究中，通過對CAFs的標記蛋白α-SMA進行免疫組織化學染色，了解其在組織中的浸潤情況，經(jīng)統(tǒng)計分析表明CAFs在食管癌鱗狀細胞癌組織中的浸潤數(shù)量明顯多于正常食管黏膜組織。將CAFs在食管癌鱗狀細胞癌組織中的浸潤情況與患者的臨床病理資料進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細胞癌組織中CAFs的浸潤數(shù)量與臨床分期、浸潤深度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關。本研究與文獻報道相似，推測CAFs在食管鱗狀細胞浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

有大量證據(jù)表明，CAFs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和最終擴散中起著重要作用，CAFs能夠通過分泌多種生長因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等細胞外基質(zhì)成分參與腫瘤的發(fā)生、生長、增殖以及轉(zhuǎn)移等過程。有研究發(fā)現(xiàn)，CAFs能夠分泌轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β)，TGF-β信號通路在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生中起著雙重作用，即在腫瘤早期階段抑制其生長，但后來則促進上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤轉(zhuǎn)移[10]。在對食管鱗狀細胞癌的器官型培養(yǎng)模型的研究中發(fā)現(xiàn)，CAFs分泌的肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)對于腫瘤細胞侵襲是必需的，且應用siRNA和藥物抑制HGF/c-Met信號通路可以有效地阻止腫瘤細胞的侵襲[11]。在缺氧等環(huán)境條件的影響下，腫瘤和基質(zhì)細胞，特別是CAFs，能夠分泌活化的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，有研究顯示食管癌中存在VEGF-A的高表達，且一些研究表明在食管鱗狀細胞癌中VEGF-A的表達與患者預后相關[12]。本研究通過對淋巴管內(nèi)皮細胞的標記蛋白D2-40進行免疫組織化學染色并對組織進行MLVD計數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計分析表明MLVD在食管癌鱗狀細胞癌組織中明顯高于正常食管黏膜組織，說明在食管鱗狀細胞癌組織中淋巴內(nèi)皮的增殖明顯。對食管鱗狀細胞癌組織中CAFs的浸潤數(shù)量與MLVD進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈正相關。由此推測，CAFs能夠促進淋巴管生成，進而參與食管鱗狀細胞癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

目前食管癌的標準療法仍局限于手術(shù)或內(nèi)鏡切除以及放化療，但食管癌的預后仍然很差，5 a生存率約為15%～25%[13]，這主要是由于未能及時診斷或判斷轉(zhuǎn)移傾向。本研究結(jié)果表明，CAFs與食管鱗狀細胞癌的浸潤和轉(zhuǎn)移等生物學行為關系密切且可能發(fā)揮重要作用，進一步探索CAFs在其中作用的具體機制，對于食管鱗狀細胞癌的早期預防和靶向治療具有重要意義。