姚 成 高文倉

原發(fā)性肺癌（以下簡稱肺癌）是我國最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)國家癌癥中心2018 年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2014 年我國肺癌發(fā)病率約78.1 萬，在男性惡性腫瘤居第1 位，女性惡性腫瘤第2 位[1]。而非小細胞肺癌（NSCLC）約占所有肺癌的85%[2]。人表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為肺癌最常見的致病突變。靶向EGFR 的酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）是目前臨床治療EGFR 致病突變NSCLC 患者的一線藥物，在改善晚期NSCLC 患者總生存期和無進展生存期方面有突出作用[3]。然而EGFR-TKIs 同樣存在耐藥現(xiàn)象，臨床上EGFR 基因突變的晚期NSCLC 在EGFR-TKIs 一線治療約10個月后，通常會因獲得性耐藥而出現(xiàn)疾病進展[4]。在獲得性耐藥機制中，EGFR T790M 突變和酪氨酸蛋白激酶Met（c-MET）基因擴增占主要地位。Wang 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKIs 獲得性耐藥約20%是由c-MET 基因擴增及下游蛋白激酶B（AKT）和細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）激活引起的。因此，c-MET 是繼EGFR、ALK 之后NSCLC 的又一分子治療靶點。中醫(yī)藥是我國腫瘤治療的重要手段之一。臨床研究顯示，中藥配合EGFR-TKIs 治療肺癌，能一定程度延長患者疾病無進展生存期[6-7]。肺金生方《金匱要略》以澤漆湯為基礎，方中多種中藥成分均有抗腫瘤作用[8-10]。本研究探討肺金生方抗非小細胞肺癌EGFRTKIs 耐藥性作用及分子機制。

1 實驗材料

1.1 動物 BALB/c 裸鼠（SPF 級），雄性，6 周齡，20～25g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2007—0005。本實驗研究經浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院動物實驗倫理審核通過（批準編號：SYXK（浙）2018-0012）。

1.2 細胞株 人非小細胞肺癌HCC827 細胞株購自上海生命科學院細胞庫（目錄號SCSP-538）。

1.3 藥物 肺金生方由澤漆、石見穿各30g，前胡10g，人參、桂枝、黃芩、半夏各9g，紅豆杉8g，蜂房15g，生姜5g 組成，由浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院中藥房配置。加水浸泡30min 后，按湯劑常規(guī)方法煎熬，過濾并濃縮成含生藥0.536g/mL 的藥液，冷卻后4℃保存。按照“人和動物之間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算出裸鼠等效劑量，設置藥物濃度為53.6g/kg。吉非替尼（商品名：易瑞沙，規(guī)格：0.25g，批號 701144）阿斯利康公司生產，加入0.9%注射用水，配置成1mg/mL 的吉非替尼混懸液。

1.4 試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)基（批號12 633012）、0.25%胰酶（批號25 300054）、胎牛血清（批號10099），購自GIBCO 公司；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（批號 556420），購自美國BD 公司；p-EGFR 單抗（批號ab40815），EGFR 單抗（批號ab40815），p-c-MET 單抗（批號ab5662），c-MET 單抗（批號ab 252205）抗體，購自美國abcam 公司；p-AKT 單抗（批號4060S），AKT 單抗（批號4685S），p-ERK 單抗（批號4370S），ERK 單抗（批號4695S）抗體，CST 公司；GAPDH 抗體，購自華安生物技術有限公司。

1.5 儀器 生物安全柜，-80℃超低溫冰箱，細胞培養(yǎng)箱，液氮罐，Thermo fisher；SynergyMx M5 全波段多功能酶標儀，Molecular Devices；金屬浴，杭州奧仟科技有限公司；低溫超速離心機，Eppendorf；細胞計數(shù)儀Countstar，上海睿鈺生物科技有限公司；ACEA NovoCyteTM 系列流式細胞儀，ACEA Biosciences；CFX-Touch 96 熒光定量PCR 儀，美國伯樂公司；Odyssey 紅外激光雙色圖像分析系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1 中藥復方制備 將肺金生方藥液在50℃煎煮2～5h，使1g 溶液含有5g 生藥，冷凍干燥成粉。用0.9%生理鹽水溶解，使用前離心5000 r/min，10min，0.22μm 微孔濾膜過濾，調節(jié)PH 值，制成體外細胞培養(yǎng)用的中藥原液，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 構建非小細胞肺癌吉非替尼耐藥細胞株 人NSCLC 細胞株HCC827 接種于6 孔板中，在培養(yǎng)基中按0、0.001、0.01、0.1、1.0、10 和100μM 濃度梯度加入吉非替尼，以誘導篩選吉非替尼耐藥細胞株。后續(xù)使用濃度為1.00μM 的吉非替尼維持細胞耐藥性。CCK8 法檢測正常HCC827 細胞株和耐藥HCC827 GR 細胞株的IC50，應用熒光定量PCR 法檢測c-MET 擴增效率。

2.3 構建皮下移植瘤模型 消化構建成功的吉非替尼耐藥細胞株接種皮下移植瘤，以每只4×107/200μL注射后肢皮下。采用隨機數(shù)字表法將20 只BALB/c裸鼠隨機分成四組：空白對照組、吉非替尼組、肺金生方組和肺金生方+吉非替尼組，每組5 只?？瞻讓φ战M給予生理鹽水125μL 腹腔注射；吉非替尼組給予吉非替尼50mg/kg 灌胃及生理鹽水125μL 腹腔注射；肺金生方組給予肺金生方劑量53.6g/kg 灌胃及生理鹽水125μL 腹腔注射；肺金生方+吉非替尼組給予吉非替尼50mg/kg+肺金生方劑量53.6g/kg 聯(lián)合灌胃給藥，并生理鹽水125μL 腹腔注射。給藥頻次設置為每2 天1 次，連續(xù)給藥4 周。4 周后取出皮下移植瘤進行稱重拍照。

2.4 CCK8 檢測肺金生方和吉非替尼對耐藥HCC827 GR 細胞增殖的作用 設置四組：空白對照組以完全培養(yǎng)液（RPMI-1640 培養(yǎng)液+10%胎牛血清）正常培養(yǎng)；吉非替尼組用完全培養(yǎng)液+終濃度為1μM 的吉非替尼；肺金生方組用完全培養(yǎng)基+肺金生方1mg/mL；肺金生方+吉非替尼組用完全培養(yǎng)基+吉非替尼1μM+肺金生方1mg/mL。培養(yǎng)48h 后，加入10μL CCK8 孵育2h 后，檢測450nm 波長處吸光度值。

2.5 流式細胞儀檢測肺金生方和吉非替尼對HCC827 GR 耐藥細胞的作用 將HCC827 GR 細胞鋪板于6 孔板中，設置四組：空白對照組用正常培養(yǎng)；吉非替尼組用終濃度為1μM 的吉非替尼；肺金生方組用肺金生方1mg/mL；肺金生方+吉非替尼組用吉非替尼1μM+肺金生方1mg/mL。培養(yǎng)24h 后，消化貼壁的細胞。調整細胞濃度為1×106，應用Annexin V-FITC（30μg/mL）/PI 染色后迅速上機檢測。

2.6 Western Blot 檢測吉非替尼和肺金生方對耐藥HCC827 GR 細胞p-EGFR/p-MET/p-AKT/p-ERK 的作用 設置四組：空白對照組正常培養(yǎng)；吉非替尼組用終濃度為1μM 的吉非替尼；肺金生方組用肺金生方1mg/mL；肺金生方+吉非替尼組用吉非替尼1μM+肺金生方1mg/mL。用含0.1% FBS 的1640 饑餓培養(yǎng)基和對應的藥物饑餓過夜，次日同時加入EGF（10ng/mL）和HGF（10ng/mL）刺激10min，檢測EGFR、磷酸化EGFR（p-EGFR）、MET、磷酸化MET（p-MET）、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）、ERK1/2、磷酸化ERK（p-ERK1/2）蛋白水平，GAPDH 作為內參。

2.7 統(tǒng)計學方法 應用GraphPad Prism 6 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均采用均數(shù)±標準差采用方差分析和t 檢驗，P＜0.05 表示差異均有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 構建非小細胞肺癌吉非替尼耐藥細胞株 CCK8檢測結果顯示，與對照組比較，吉非替尼誘導的耐藥細胞株HCC827 GR 的細胞活力在吉非替尼濃度達到0.10、1.0μM 時明顯高于正常HCC827 細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.01），同時吉非替尼在1.0μM時對正常HCC827 細胞具有明顯的殺傷作用，但是對耐藥細胞株HCC827 GR 的抑制作用明顯降低，后續(xù)將使用濃度為1.0μM 的吉非替尼維持細胞耐藥性。同時對正常和耐藥HCC827 細胞株c-MET 表達水平進行mRNA 水平的鑒定，結果顯示，耐藥細胞株HCC827 GR 的c-MET 轉錄水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。提示HCC827 吉非替尼耐藥細胞株構建成功，同時該細胞株具有明顯的c-MET 擴增。見表1-2。

表1 各組吉非替尼處理后細胞活力比較（%，±s）

表1 各組吉非替尼處理后細胞活力比較（%，±s）

注：HCC827 組為人非小細胞肺癌對照組；HCC827GR 組為人非小細胞肺癌耐藥組；與HCC827 組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

表2 各組吉非替尼處理后c-MET mRNA 相對表達水平比較（±s）

表2 各組吉非替尼處理后c-MET mRNA 相對表達水平比較（±s）

注：HCC827 組為人非小細胞肺癌對照組；HCC827GR 組為人非小細胞肺癌耐藥組；與HCC827 組比較，aP＜0.01

3.2 吉非替尼聯(lián)用肺金生方對耐藥HCC827 GR 細胞皮下移植瘤的作用 與空白對照組比較，吉非替尼組小鼠皮下移植瘤瘤重無差異（P＞0.05），肺金生方處理組小鼠皮下移植瘤瘤重減輕，吉非替尼+肺金生方組小鼠皮下移植瘤重明顯小于吉非替尼組及肺金生方組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表3、圖1。

表3 各組小鼠皮下移植瘤瘤重比較（g，±s）

表3 各組小鼠皮下移植瘤瘤重比較（g，±s）

注：空白對照組給予0.9%生理鹽水腹腔注射；吉非替尼組給予吉非替尼50mg/kg 灌胃及生理鹽水腹腔注射；肺金生方組給予肺金生方劑量53.6g/kg 灌胃及生理鹽水腹腔注射；吉非替尼+肺金生方組給予吉非替尼50mg/kg+肺金生方劑量53.6g/kg 聯(lián)合灌胃，并生理鹽水腹腔注射；與空白對照組比較，aP＜0.01；與吉非替尼組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與肺金生方組比較，cP＜0.01

3.3 吉非替尼聯(lián)用肺金生方對耐藥HCC827 GR 細胞增殖的影響 與空白對照組比較，肺金生方組和吉非替尼+肺金生方組明顯降低耐藥HCC827 GR 細胞的增殖能力，差異有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.01）。增殖能力：吉非替尼+肺金生方組＜肺金生方組＜吉非替尼組＜對照組。見表4。

3.4 吉非替尼聯(lián)用肺金生方對耐藥HCC827 GR 細胞早期凋亡的影響 與空白對照組比較，吉非替尼組、肺金生方組以及吉非替尼+肺金生方組細胞的凋亡明顯增加。凋亡率：空白對照組（3.05±0.54）%＜吉非替尼組（7.38±0.45）%＜肺金生方組（7.40±0.56）%＜吉非替尼+肺金生方組（12.80±0.72）%。見圖2。

表4 各組細胞增殖率比較（%，±s）

表4 各組細胞增殖率比較（%，±s）

注：空白對照組給予腹腔注射0.9%生理鹽水；吉非替尼組給予吉非替尼50mg/kg 灌胃及0.9%生理鹽水腹腔注射；肺金生方組給予肺金生方劑量53.6g/kg 灌胃及0.9%生理鹽水腹腔注射；吉非替尼+肺金生方組給予吉非替尼50mg/kg+肺金生方劑量53.6g/kg 聯(lián)合灌胃，并生理鹽水腹腔注射；與空白對照組比較，aP＜0.01；與吉非替尼組比較，bP＜0.01

3.5 吉非替尼聯(lián)用肺金生方對耐藥HCC827 GR 細胞p-EGFR/p-MET/p-AKT/p-ERK 的作用 與空白對照組比較，吉非替尼組略微降低EGFR 磷酸化信號，但是并不能明顯影響p-c-MET 以及下游信號p-AKT/p-ERK1/2 信號。肺金生方組和吉非替尼+肺金生方組c-MET 和p-c-MET 的水平明顯降低，同時下游p-AKT/p-ERK1/2 水平也明顯降低。GAPDH 作為內參。見圖3。

圖1 肺金生方聯(lián)用吉非替尼對吉非替尼耐藥皮下移植瘤的作用

圖2 肺金生方聯(lián)用吉非替尼對耐藥細胞早期凋亡的影響

圖3 藥物聯(lián)用對耐藥細胞株p-EGFR/p-MET/p-AKT/p-ERK1/2 的作用

4 討論

盡管通過引入EGFR-TKIs 治療晚期NSCLC EGFR 基因突變患者的臨床結果有所改善，但是由于內在或獲得性耐藥的發(fā)生，預后仍然較差。研究發(fā)現(xiàn)，HGF/c-MET 信號通路的異常激活是EGFR-TKIs產生耐藥的一個重要原因，約占NSCLC 患者中EGFR-TKIs 獲得性耐藥的20%[11-13]。肺金生方的多種主要組分在抗腫瘤中發(fā)揮著重要的作用[14-17]。而目前關于肺金生方方劑抗EGFR-TKIs 耐藥的研究尚未見報道。本研究結果顯示，誘導耐藥株存在明顯的c-MET 擴增。本研究結果還顯示吉非替尼組皮下移植瘤和空白對照組比較無明顯減輕，說明該移植瘤確實產生了吉非替尼耐藥。肺金生方組移植瘤瘤重明顯較空白對照組減輕，證明肺金生方能夠抑制吉非替尼耐藥的皮下移植瘤的生長。吉非替尼+肺金生方組皮下移植瘤瘤重明顯較空白對照組和吉非替尼組減輕，再次說明肺金生方能逆轉吉非替尼耐藥的表型。體外實驗結果顯示，肺金生方和吉非替尼聯(lián)用明顯抑制吉非替尼耐藥誘導的細胞增殖，并誘導細胞凋亡。HGF/c-MET 誘導EGFR-TKIs 獲得性耐藥的分子機制為c-MET 擴增與異常活化，以及下游AKT和ERK1/2 磷酸化。本研究結果顯示，肺金生方能明顯抑制吉非替尼耐藥導致的c-MET 擴增以及下游AKT 和ERK1/2 的磷酸化，兩藥聯(lián)用后效果更明顯。肺金生方可能通過抑制HGF 受體c-MET 蛋白表達及活化，從而抑制HGF/c-MET 信號通路的異常激活誘導的吉非替尼耐藥。