廖威，方麗娟，鄧旭怡，羅小琴，雷春洪，王剛

（江西迪安華星醫(yī)學(xué)檢驗實驗室，江西 南昌 330096）

檢測系統(tǒng)的分析性能驗證是臨床檢驗質(zhì)量管理 的 重 要 內(nèi) 容 。 CNAS-CL02：2012 （ISO15189：2012IDT）[1]指出，在常規(guī)應(yīng)用前，應(yīng)由實驗室對未加修改而使用的已確認(rèn)的檢驗程序進(jìn)行獨立驗證。驗證過程證實的檢驗程序的性能指標(biāo)，應(yīng)與檢驗結(jié)果的預(yù)期用途相關(guān)。CNAS-CL02-A009[2]指出，定量檢測方法和程序的分析性能驗證內(nèi)容至少包括精密度、正確度、線性范圍、抗干擾能力等驗證。正常健康人體內(nèi)不含HCV-RNA，所以檢出限的驗證也是重要的驗證環(huán)節(jié)。本實驗室HCV-RNA定量檢測系統(tǒng)使用磁珠法提取核酸,提取效率較柱抽提法高[3]。由于PCR檢測項目相對其他專業(yè)的檢測項目來說，驗證的標(biāo)本獲取相對困難，且驗證內(nèi)容和驗證方法不完全一致。本文以CNAS文件和中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)頒布的系列文件為依據(jù),對新使用的HCV-RNA定量檢測系統(tǒng)進(jìn)行性能驗證，評估并分析其臨床應(yīng)用價值?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 HCV-RNA低值S5和高值S3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來自北京康徹斯坦生物技術(shù)有限公司；2017年和2018年衛(wèi)生部臨床檢驗中心室間質(zhì)評標(biāo)本，共 10 份,編號為：201721～201725、201811～201815；HCV-RNA高值陽性血清為本實驗室收集的高濃度臨床陽性標(biāo)本；HCV-RNA陰性血清為本實驗室收集的已證實肝功能、乙肝兩對半、丙肝抗體和HCV RNA全為陰性的體檢標(biāo)本。所有標(biāo)本于-70℃冰箱保存。

1.2 儀器與試劑 美國ABI7500熒光定量PCR儀,湖南圣湘生物科技有限公司丙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）,批號2018001。

1.3 實驗方法

1.3.1 精密度驗證 參照WS/T 492-2016[4]文件。將HCV-RNA高濃度陽性標(biāo)本進(jìn)行10倍梯度稀釋至濃度范圍 為106 IU/ml和103 IU/ml的高低兩個濃度水平，每天分析一個批次，每個水平重復(fù)測定4次，連續(xù)測定5d，每個水平累計得到20個數(shù)據(jù)。計算批內(nèi)精密度(CV批內(nèi))和總精密度(CV批總)。

1.3.2 標(biāo)本攜帶污染驗證 使用HCV-RNA高濃度陽性標(biāo)本44例、陰性標(biāo)本44例，交叉排列。同時提取、擴增，驗證檢測系統(tǒng)抗污染能力。要求陰性血清檢測結(jié)果仍為陰性，則驗證通過。

1.3.3 正確度驗證 檢測衛(wèi)生部臨床檢驗中心2017年和2018年全國室間質(zhì)評活動的標(biāo)本10個（編號為：201721～201725；201811～201815）,按照國家衛(wèi)生部臨床檢驗中心的判斷標(biāo)準(zhǔn),要求結(jié)果落在靶值±0.4 Log值為符合要求,10個標(biāo)本至少8個符合要求為驗證通過。

1.3.4 分析測量范圍驗證 參照WS/T 420-2013[5]文件。將HCV-RNA高濃度陽性標(biāo)本用陰性血清進(jìn)行系列 10 倍梯度稀釋（1：10、1：100、1：1000…）至試劑說明書聲明的分析測量范圍下限,將高濃度陽性標(biāo)本和所有稀釋度標(biāo)本在同一批檢測,每個濃度標(biāo)本重復(fù)測量3次，計算測定Log值和預(yù)測Log值進(jìn)行線性回歸分析,要求b在1±0.05范圍內(nèi)，a接近于0，R2≧0.95，且測定Log值和理論Log值的差值≦±0.4 Log值，則驗證通過。

1.3.5 定量限和檢出限 參照WS/T 514-2017[6]文件。使用陰性血清將康徹斯坦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：2.2*103 IU/ml（對數(shù)值為3.34）稀釋至2次方的濃度值，然后再進(jìn)行5個梯度的倍比稀釋,對稀釋后的標(biāo)本每天分析一個批次，每個稀釋度重復(fù)檢測7次，連續(xù)測定3天，每個水平累計得到21個數(shù)據(jù)，并得出檢出和未檢出兩種情況，如檢出，則根據(jù)濃度值的對數(shù)值求出均值、SD和CV,選擇CV小于允許精密度要求的稀釋度時的最低濃度作為定量限。當(dāng)檢出結(jié)果比例大于或等于95%時的稀釋度濃度，則為檢出限?；驒z測生產(chǎn)企業(yè)聲稱濃度值的樣本25次，至少22次檢出，則為檢出限[7]。

1.3.6 特異性驗證 使用試劑盒對實驗室已確證的HCV-RNA陰性但甲型肝炎病毒（HAV）、乙肝肝炎病毒(HBV)、梅毒螺旋體（CT）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、EB病毒（EB）、單純皰疹病毒（HSV）陽性標(biāo)本進(jìn)行HCV-RNA檢測，檢測結(jié)果為陰性則符合要求。

1.3.7 抗干擾能力驗證 使用接近或高于廠家聲明濃度的膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯和總IgG的HCV-RNA陰性樣本，10倍稀釋外觀正常的高濃度HCV-RNA標(biāo)本，重復(fù)檢測稀釋后的標(biāo)本5次，HCV-RNA測定均值與預(yù)期值的偏倚應(yīng)在±0.4 Log值范圍內(nèi)。原始高濃度HCV-RNA標(biāo)本用正常陰性血清稀釋復(fù)測3次的Log均值作為預(yù)期值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Excel 2007軟件對批內(nèi)精密度、總精密度、抗干擾試驗、正確度、分析測量范圍、檢出限、定量限及特異性結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗證結(jié)果 低濃度和高濃度標(biāo)本的批內(nèi)精密度和總精密度均≤5%，符合廠家聲明。見表1。

2.2 標(biāo)本攜帶污染驗證結(jié)果 將高濃度陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本共88個進(jìn)行穿插排列,同時提取和PC R擴增，陰性結(jié)果全為陰性，均無交叉污染。見表2。

表1 精密度試驗結(jié)果

表2 標(biāo)本攜帶污染驗證結(jié)果

2.3 正確度驗證結(jié)果 采用衛(wèi)生部臨床檢驗中心室間質(zhì)評標(biāo)本（編號： 201721～201725、201811～201 815）評估正確度，全部通過，正確度符合要求。見表3。

表3 正確度驗證結(jié)果

表4 分析測量范圍驗證結(jié)果

2.4 分析測量范圍驗證結(jié)果 實驗室收集到的最高濃度標(biāo)本為1.98×107IU/ml，對其進(jìn)行系列10倍梯度稀釋至19.8IU/ml，驗證的分析測量范圍為（19.8～1.98×107）IU/ml， 廠家聲明的分析測量范圍為（50～1×108）IU/ml，驗證通過。 見表 4、圖 1。

2.5 定量限和檢出限驗證 廠家聲明的定量限為50 IU/ml，Log值為1.70，按照衛(wèi)生部臨床檢驗中心室間質(zhì)評的判斷標(biāo)準(zhǔn)，TEa在±0.4的范圍內(nèi)可接受，則在該濃度的TEa為23.5%,參照CNAS-CL 02-A009附錄A,在定量限濃度處的精密度允許范圍為4/5 TEa（18.8%）。標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過稀釋后接近定量限時的濃度為55 IU/ml，Log值為1.74,正確度在允許范圍（1.34～2.14）內(nèi)。驗證的定量限實測濃度的Log均值為1.51，CV為16.06%，精密度也在允許范圍內(nèi)，定量限驗證通過。廠家聲明的檢出限為25 IU/ml,在濃度值為22.5 IU/ml時，21次檢測中檢出20次，檢出結(jié)果大于95%，檢出限驗證也通過。見表5。

圖1 分析測量范圍驗證回歸曲線

表5 定量限和檢出限驗證結(jié)果

2.6 特異性驗證結(jié)果 HCV-RNA檢測試劑盒與甲型肝炎病毒（HAV）、乙肝肝炎病毒（HBV）、梅毒螺旋體（CT）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、EB 病毒（EB）、單純皰疹病毒（HSV）病原體感染的標(biāo)本無交叉反應(yīng)，特異性符合要求。見表6。

表6 特異性驗證結(jié)果

2.7 抗干擾能力驗證結(jié)果 高膽紅素（550mmol/L）、高血紅蛋白（23g/L）、高甘油三酯（40mmol/L）和總IgG（45g/L）對檢測結(jié)果的影響在允許的偏倚范圍內(nèi)，符合廠家聲明。見表7。

3 討論

丙型肝炎呈全球性流行,據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計（2014）,全球HCV的感染率約為2.8%,估計約1.85億人感染HCV，其中約1.5億為慢性感染，每年因HCV感染導(dǎo)致的死亡病例約35萬例。但由于HCV感染具有隱匿性,多數(shù)感染者并不知道感染HCV。暴露于HCV后1～3周，在外周血可檢測到HCV RNA。HCV RNA定量檢測主要用來檢測HCV在血液中的含量，適用于HCV現(xiàn)癥感染的確認(rèn)、抗病毒治療前基線病毒載量分析、以及抗病毒治療過程中及治療后的應(yīng)答評估[8]。無論急性還是慢性丙型肝炎病毒感染，確診均有賴于HCV RNA的檢測,并由于丙肝患者在應(yīng)用聚乙二醇干擾素聯(lián)合RBV治療方案時，高靈敏的HCV-RNA檢測試劑有助于更準(zhǔn)確鑒定RVR,從而為確定抗病毒治療療程提供更可靠的依據(jù)[8，9]。由此可見，HCV RNA定量檢測對于臨床丙型肝炎的診治具有重要的意義。

表7 抗干擾能力驗證結(jié)果

本文的HCV RNA定量檢測系統(tǒng)，使用的是湖南圣湘的檢測試劑,廠家的說明書中明確說明了使用ABI7500熒光定量PCR分析儀進(jìn)行擴增的程序，并提供了該檢測系統(tǒng)對應(yīng)的產(chǎn)品性能指標(biāo)。對于此類廠家能夠提供完整產(chǎn)品性能指標(biāo)的檢測系統(tǒng)，可以當(dāng)做封閉系統(tǒng)來對待，只需要對檢測系統(tǒng)做基本的性能驗證實驗即可,無需進(jìn)行更加繁瑣的性能確認(rèn)實驗。CNAS文件明確指出分子診斷領(lǐng)域定量檢測方法和程序的分析性能驗證內(nèi)容，中國人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等對各性能指標(biāo)的驗證方法提供了具體的實驗方案,本文旨在對本實驗室的HCV RNA定量檢測系統(tǒng)進(jìn)行性能驗證，為PCR定量方法學(xué)的性能驗證提供方案。具體驗證內(nèi)容包括精密度、標(biāo)本攜帶污染、正確度、分析測量范圍、檢出限和定量限、特異性以及抗干擾能力。由于PCR定量項目的數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布,在進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計時,均將初始濃度轉(zhuǎn)化成對數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計。畢波和呂元的文章[10]指出，不同檢測項目應(yīng)選擇不同的方法學(xué)驗證實驗,對于低值特別有意義的檢測項目，必須進(jìn)行功能靈敏度的驗證實驗，也就是本文中所進(jìn)行的檢出限和定量限驗證，由于HCV RNA屬于病原體微生物，在正常人體內(nèi)不含有，所以微量的病毒檢出具有重要的臨床意義。畢波和呂元的文章中還指出,檢測系統(tǒng)良好的精密度和無標(biāo)本攜帶污染是進(jìn)行其他驗證實驗的前提，然后再進(jìn)行正確度驗證，最后可依次進(jìn)行最大稀釋度驗證、功能靈敏度驗證實驗和分析測量范圍驗證實驗，本文的驗證實驗順序跟其基本一致。精密度驗證方案本研究參考的是WS/T 492-2016[4]。通過對接近廠家聲明的線性范圍上限的高濃度標(biāo)本（1.98×107IU/ml）進(jìn)行 10倍梯度稀釋，獲得一系列的等比稀釋后的標(biāo)本,使用6次方的高值標(biāo)本和3次方的低值標(biāo)本進(jìn)行精密度驗證,其他系列濃度的樣本和精密度驗證后多余的樣本于-70℃冰箱保存，用于分析測量范圍驗證。所有樣本避免反復(fù)凍融，保證樣本的穩(wěn)定性。

標(biāo)本攜帶污染驗證使用的臨床收集到的不同濃度的高值標(biāo)本和陰性血清，高濃度樣本和陰性樣本各44份，交叉排列，外加1個陰性對照、1個陽性對照、高低濃度2個質(zhì)控品和4個標(biāo)準(zhǔn)品，共96孔，布滿整版，保證每孔均被驗證。

WS/T 492-2016 和 WS/T 420-2013[4，5]均指出，可以使用患者樣本與其他檢驗方法比較進(jìn)行正確度驗證實驗,也可以使用參考物質(zhì)進(jìn)行正確度驗證實驗。若使用參考物質(zhì)進(jìn)行正確度驗證實驗，可以選擇大型能力比對或室間質(zhì)評的樣本。本文選擇的是使用衛(wèi)生部臨床檢驗中心2017年和2018年下發(fā)的2次共10個樣本進(jìn)行驗證，正確度符合要求。

廠家聲明的分析測量范圍為50～108IU/ml。依據(jù)WS/T 420-2013[5]中線性驗證相關(guān)內(nèi)容,結(jié)合WS/T 408-2012[11]和相關(guān)文獻(xiàn)[12-14]，本方案中選用的上限標(biāo)本濃度為1.98×107IU/ml,下限標(biāo)本選用陰性血清，驗證得到的分析測量范圍為（19.8～1.98×107）IU/ml，符合廠家聲明。

定量限指滿足聲明的精密度和正確度,在聲明的實驗條件下能夠可靠定量的分析物的最低濃度。WS/T 514-2017指出，最簡單的檢測限試驗設(shè)計應(yīng)包括一個試劑批號；一個儀器系統(tǒng)；3天實驗；2個LoD和LoQ聲明濃度附近的標(biāo)本;總計至少2 0個重復(fù)檢測結(jié)果[6]。本文正是以此制定實驗方案,通過正確度和精密度的結(jié)果綜合判斷定量限。定量限的精密度要求是根據(jù)廠家說明的定量限濃度、CNAS-CL02-A009文件附錄A和衛(wèi)生部臨床檢驗中心室間質(zhì)評的判斷標(biāo)準(zhǔn)計算得出,為18.8%,與應(yīng)葳,李萬春,宋濤，等人的文章[12]中說明的20%接近。通過驗證表明，本實驗室HCV RNA檢測系統(tǒng)的定量限為55 IU/ml，接近廠家聲明。檢出限為22.5 IU/ml，小于廠家聲明。說明驗證的定量限和檢出限均符合廠家聲明。

依據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的 《丙型肝炎病毒核酸測定試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》[15]，推薦用于特異性研究的微生物包括HCMV、EBV、HSV2等13種,推薦用于干擾研究的物質(zhì)包括膽紅素、血紅蛋白和甘油三酯等7種，其中膽紅素、血紅蛋白和甘油三酯為必須驗證的干擾物質(zhì)。由于各類陽性病原微生物難以獲得,本實驗選擇甲型肝炎病毒（HAV）、乙肝肝炎病毒（HBV）、梅毒螺旋體（CT）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、EB 病毒（EB）、單純皰疹病毒（HSV）6種病毒進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗證，使用總膽紅素（550 mmol/L）、血紅蛋白（23 g/L）、甘油三酯（40 mmol/L）和總 IgG（45 g/L）4 種臨床常見的干擾物質(zhì)進(jìn)行驗證，均符合要求。

通過以上驗證結(jié)果表明,在高低值分別為6次方和3次方濃度時的批內(nèi)精密度和總精密度均符合要求；無標(biāo)本攜帶污染；正確度符合衛(wèi)生部臨床檢驗中心室間質(zhì)量評價要求；在50～108IU/ml分析測量范圍內(nèi)線性良好;檢出限和定量限符合廠家聲明；特異性驗證通過；高濃度的血紅蛋白、膽紅素、總IgG和甘油三酯均對試驗無明顯干擾。綜上所述，本文建立的HCV RNA定量檢測系統(tǒng)的性能驗證方案合理,驗證的各項性能指標(biāo)均符合廠家聲明，適用于臨床檢測。