王藝芳,葛文超,李俊英,李建斌,方建華

（河南省紅十字血液中心檢驗科，河南 鄭州 450012）

《衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》明確提出：要完善無償獻血服務體系,加強血站血液安全保障能力建設，積極推進血站核酸檢測工作，提高血站實驗室檢測能力。2015年，河南省還沒有全面開展核酸檢測，在河南省衛(wèi)計委協(xié)調下，由河南省紅十字血液中心、洛陽市中心血站、焦作市中心血站3個核酸檢測實驗室承擔全省18家血站核酸檢測任務。血液中心檢驗科核酸檢測實驗室承擔了7家地市級中心血站的核酸集中化檢測工作，實現(xiàn)了2015年底核酸檢測全覆蓋?，F(xiàn)將一年來的集中化檢測工作報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2015年10月-2016年12月31日省血液中心和七家中心血站采集的358923例經(jīng)2種不同廠家的試劑進行2遍ELISA檢測HBsAg/抗-HCV/抗-HIV1/2均無反應性的無償獻血者標本。獻血者均符合國家《獻血者健康檢查要求》（GB-2012）要求。采集血液時留取用于ELISA和NAT檢測的標本,其中NAT標本在采樣后4h內于2~8℃的低溫離心機以1760g離心20min，離心后2~8℃臨時保存，并在4h內運到實驗室。標本運輸和保存完全按照 《血站技術操作規(guī)程2015版》中相關要求進行操作。

1.2 主要試劑和儀器 科華核酸檢測系統(tǒng)：NAT試劑（上?？迫A生物工程股份有限公司），試劑批號：20151013、20151114、20151115 等, 配套耗材由試劑公司提供，均在有效期內使用。Hamilton Star全自動混樣儀(瑞士HAMILTON公司),ABI 7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）,低溫大容量離心機KUBOTA 8730（日本KUBOTA公司）。

1.3 實驗方法 去除酶免檢測HBsAg/抗-HCV/抗-HIV1/2雙試劑陽性的標本，采用科華核酸檢測系統(tǒng)先進行HBV/HCV/HIV核酸定性8混樣檢測，混樣檢測陽性再進行拆分檢測,實驗操作嚴格按儀器和試劑盒說明書進行。結果判定：混樣有陽性而拆分陰性的標本則判為NAT陰性,混樣有陽性拆分也有陽性的標本則判為NAT陽性。

1.4 質量控制 標本和試劑的運輸和保存完全按照《血站技術操作規(guī)程2015版》中相關要求進行操作。標本檢測全過程由試劑盒的質控品和室內質控品對實驗進行有效控制。本實驗室定期參加國家衛(wèi)計委臨床檢驗中心組織的室間質量評價活動和CITIC血液篩查室間質評項目。

1.5 集中化檢測模式 7個中心血站的NAT標本均是經(jīng)過兩遍ELISA檢測過的標本(雙陽性除外)。省血液中心和7個中心血站分別簽訂了 《委托檢驗協(xié)議書》明確了血液集中化檢測機構間的權利和義務,規(guī)定了各集中化檢測機構進行相應的血液及標本的采集、運送，移交，檢測、檢驗結果的發(fā)送與接收等內容。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NAT檢測結果 對ELISA檢測陰性（酶免雙試劑陽性標本除外）的其中358 923例標本進行NAT結果，見表 1、表 2,共檢出 286例 HBV DNA+、1例HCV RNA+和9例HIV RNA+。總的NAT陽性率為0.82‰，總的NAT結果無效率0.22%，總的NAT拆分陽性率61.16%。E血站NAT陽性率最高(2.06‰),B血站次之(1.41‰),最低為血液中心（0.46‰）,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。A 血站 NAT 結果無效率最高（0.57%）,其次是 G 血站（0.34%），血液中心最低（0.07%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。E血站NAT拆分陽性率最高 （77.91%），A血站次之（74.07%），F(xiàn) 血站最低（49.37%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。

2.2 每月NAT陽性率、NAT結果無效率和NAT拆分陽性率 每個月的NAT陽性檢出率前期平均在0.94‰，后期則比較平穩(wěn),見圖1。NAT結果無效率前期較高，后期降低，整體呈下降趨勢,見圖2。NAT拆分陽性率則大部分維持在50~72%（8月份例外），只有最后兩個月較低25~35%,見圖3。

表1 集中化核酸檢測結果（n=358 923）

表2 集中化核酸檢測結果核酸檢測陽性項目類型（n=358 923）

圖1 2015年-2016年每月NAT陽性檢出率

圖2 2015年-2016年每月NAT無效率

3 討論

病毒核酸檢測技術（NAT）是直接檢測病原體核酸的一系列技術的總稱,相比血清學抗原抗體檢測方法（EIA），血液病毒核酸檢測技術可以有效縮短抗原抗體免疫檢測的“窗口期”，從而大大降低經(jīng)輸血傳播病毒的風險[1,2]。雖然，從理論上NAT并不能完全消除病毒感染的窗口期,但可以有效地預防經(jīng)輸血傳播病毒性疾病[3]。

圖3 2015年-2016年每月NAT拆分陽性率

科華核酸檢測系統(tǒng)在2015年10月-2016年12月共檢測了358923例標本,其中納入集中化檢測的7個中心血站標本259342例，占72.25%。從表1可以看出7個血站以及血液中心之間NAT陽性率、NAT無效率、拆分陽性率有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。NAT總陽性率0.82‰，也高于該試劑實驗室之前報道的0.30‰[4]，略高于上海0.63‰[5]和西安0.66‰[6]，低于上饒 2.60‰[7]、 杭州 2.00‰[8]、 合肥1.62‰[9]和烏魯木齊 1.10‰[10]，南京 0.94‰[11]。 其中E血站NAT陽性率最高 （2.06‰），B血站NAT陽性率1.41‰次之,血液中心NAT陽性率0.46‰最低。分析原因可能是：7個血站的標本全部送到血液中心集中檢測,各個單位血液篩查實驗室的酶免檢測HBsAg/抗-HCV/抗-HIV1/2所用試劑、酶免設備和人員操作水平以及不同地區(qū)流行病學特點也不盡相同，可能在某種程度上提升了NAT陽性率。因此對于不同地區(qū)獻血者人群中HBV/HCV/HIV病毒感染差異性的現(xiàn)象及原因，有待進一步探討。

在集中化期間,每個月的NAT陽性率前8個月平均在0.94‰,后5個月則比較平穩(wěn),見圖1。N AT無效率前6個月較高，后幾個月降低，整體呈下降趨勢（見圖2），可能與前期送檢標本的質量和設備的超負荷遠轉,直接影響了核酸檢測結果的有效性。NAT拆分陽性率則大部分維持在50～72%（8月份例外）,只有最后兩個月較低25～35%（見圖3）。通過對這些質量監(jiān)控指標的分析，筆者發(fā)現(xiàn)了實驗室在集中化檢測期間的一些問題：集中化檢測期間,標本量的驟增使實驗室和人員的超負荷工作運轉以及機器設備不能得到良好的維護和保養(yǎng),這有可能是造成每月NAT陽性檢出率和拆分率要比之前實驗室報道略高[4]的原因。國內外的報道也表明，核酸檢測過程中存在假反應性現(xiàn)象[12-14]，原因可能是一定的實驗室污染導致非特異性擴增，防污染是核酸檢測必須重視的重要問題[12]。另外,在集中化最初也發(fā)現(xiàn)了一些影響血液檢測質量的一些疏漏環(huán)節(jié),如由于送檢單位之前從未進行NAT標本的采集和送檢,送檢標本標簽的粘貼不規(guī)范，標本出現(xiàn)溶血、脂血以及量不足等諸多標本質量問題影響血液檢測。通過和各送檢單位溝通和培訓，建立統(tǒng)一的標本質量標準后，標本質量得以解決。

實施集中化檢測后，全面開展血液核酸檢測，最大限度的保障了集中化檢測區(qū)域內所有血站的血液質量安全[15]。目前河南省境內集中化檢測任務已經(jīng)結束，中心血站都建立了各自的NAT實驗室。但是，每個血站僅有一個NAT實驗室和一套NAT設備，若遇實驗室污染或緊急情況時，沒有備用實驗室，勢必會造成結果無法按時發(fā)布，血液不能及時發(fā)往臨床。故筆者建議，將河南省內所有中心血站(包括血液中心)NAT實驗室結合實驗室場地、設備類型、人員、信息系統(tǒng)、地域位置、血站現(xiàn)狀等實際情況進行綜合評估，選出信息對接方便、設備運行良好、人員資質較高和交通便利的NAT實驗室作為其他地區(qū)的互助實驗室,實行優(yōu)勢資源互補。

本血液中心承擔的7家血站核酸集中化檢測任務,利用了血液中心運行相對成熟的核酸實驗室,并在規(guī)定時間內完成集中化地區(qū)核酸檢測的全覆蓋，有效防止了病毒經(jīng)血液傳播，保障了區(qū)域內的血液安全。此次核酸集中化檢測各家血站的數(shù)據(jù)信息可以為其后期開展核酸檢測作為參考。