范希景 傅媛 方莉萍 項曦 王金華 浮苗

線粒體DNA（mtDNA）特別是非編碼控制區(qū)（D-loop 區(qū)）突變在宮頸癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝細胞癌、肺癌和腎細胞癌中均有發(fā)現(xiàn)，是腫瘤研究領(lǐng)域中的熱點［1-2］。線粒體除提供能量和產(chǎn)生活性氧（ROS）外，還參與細胞凋亡，其D-loop 區(qū)含有控制mtDNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列［3］。甲狀腺腫瘤有逐年增高的趨勢，其發(fā)病機制和治療引起廣泛關(guān)注［4］。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤雖是良性病變，但有合并癌及癌變的可能性。本文探討mtDNA D-loop 區(qū)突變在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤致病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2018 年4 月至2019 年4 月本院無遺傳關(guān)系的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤患者74 例，均由＞2位病理醫(yī)師診斷。排除其他組織、臟器腫瘤；糖尿病、高血壓；已接受放化療和藥物治療；與線粒體突變有關(guān)疾病者。男女比例約1 ∶2，平均年齡（47.41±10.59）歲。收集同一患者的腫瘤組織和附近正常組織（距離腫瘤組織＞5cm），以及外周靜脈血2ml。本項目經(jīng)本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）DNA 抽提：提取組織和血液細胞總DNA，使用DNA 提取試劑盒（天根有限公司，中國）。（2）PCR 擴增：設(shè)計用于擴增mtDNA D-loop 區(qū)域的引物序列，L15975F: 5'-CTCCACCATTAGCACCCAAAGC-3'，H794R: 5'-AGGCTAAGCGTTTTGAGCTG-3'。使用PCR擴增試劑盒（TaKaRa，日本）進行PCR，在PCR 反應(yīng)管中依次加入下列物質(zhì)：2×PCR Premix 25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，模板DNA2μl，滅菌雙蒸水補足至終體積為50μl。PCR 擴增：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，35 個循環(huán)；72℃延伸4min 擴增。取2μl 反應(yīng)產(chǎn)物，在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳。對于擴增效果良好且足量的樣品，進一步進行純化和測序。（3）測序：委托杭州擎科生物公司進行測序，所有樣品均進行雙向測序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件。計量資料以（±s）表示，用t 檢驗；計數(shù)資料以n 表示，用卡方檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴增結(jié)果 所有結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤組織、瘤旁正常組織和外周血均擴增出1543bp 片段，見圖1。

2.2 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤患者mtDNA D-loop 區(qū)多態(tài)性變化 本研究中74 例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤患者，共發(fā)現(xiàn)107（303-309 按一個點）個多態(tài)性變異，人均變異數(shù)為1.45 個，所有變異均有報道，如A73G，G103A，A263G 等。劍橋序列中303-309 位點共有7 個C 堿基，稱之為C7，在303-309 位點會插入或缺失若干個C 堿基，插入一個C 堿基即C8，兩個C 堿基為C9，以此類推；另外也會在523 缺失A 堿基，524 位點缺失C堿基。有10 例標本出現(xiàn)以上多態(tài)性改變，見表1。

圖1 mtDNA D環(huán)擴增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖

表1 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤mtDNA D-loop 區(qū)部分多態(tài)性變化

2.3 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤患者mtDNA D-loop 區(qū)點突變 13 例患者攜帶mtDNA D-loop 區(qū)點突變，突變率為17.57%（13/74），出現(xiàn)A-C，T-C，delAC、G-C 等基突變，異質(zhì)性為38.46%（5/13）。其中10 例患者均攜帶HVR-I 區(qū)（16024～16324）和HVR-II 區(qū)（63～322）兩個高變區(qū)突變，其中HVR-II 區(qū)占53.85%（7/13）。見表2，圖2。

表2 甲狀腺腫瘤患者 mtDNA D-loop 區(qū)點突變

圖2 測序結(jié)果堿基替換圖

2.4 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤患者臨床資料分析 mtDNA D-loop 區(qū)突變組與非突變組比較，各臨床指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤患者臨床資料分析（±s）

表3 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤患者臨床資料分析（±s）

注：T3代表三碘甲狀腺氨酸，T4代表甲狀腺素，TSH代表促甲狀腺素，F(xiàn)T3代表游離三碘甲狀腺原氨酸，F(xiàn)T4代表三碘甲狀腺氨酸

臨床指標 mtDNA D-loop非突變患者（n=61）mtDNA D-loop突變患者（n=13） P值性別比（男∶女） 21∶41 2:11 ＞0.05年齡 45.72±11.33 50.32±12.66 ＞0.05有家族史例數(shù) 4 1 ＞0.05腫瘤大?。╟m2） 5.24±5.07 6.22±4.23 ＞0.05 T3 1.57±0.30 1.62±0.08 ＞0.05 T4 113.80±26.02 108.67±13.4 ＞0.05 TSH 1.45±0.86 1.32±0.97 ＞0.05 FT3 4.38±0.41 4.29±0.63 ＞0.05 FT4 13.16±2.4 12.54±2.21 ＞0.05

3 討論

線粒體基因組特別易發(fā)生突變，是由于細胞器中產(chǎn)生高水平的活性氧（ROS）和低水平的錯配修復(fù)基因（MMR）［5-6］，且D-loop 區(qū)是人類線粒體基因組中最可變部分［7］。研究發(fā)現(xiàn)，尤其是HVR-I 和HVR-II這兩個高變區(qū)，堿基替換率高于mtDNA 其他區(qū)域6～8倍［8］。然而，目前對mtDNA 突變位點的研究大多在惡性腫瘤中，國內(nèi)外研究人員已在直腸癌、胃癌、甲狀腺乳頭狀癌及乳腺癌中檢測到相應(yīng)的mtDNA 突變，突變率最高達61%［9-11］。

本研究對74 例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤患者mtDNA D-loop 區(qū)測序發(fā)現(xiàn)107 個多態(tài)性位點，人均變異數(shù)為1.45 個。mtDNA nt303～309 區(qū)域是D-loop 區(qū)最常發(fā)生變異的區(qū)域，插入或缺失1～3 個PloyC 結(jié)構(gòu)［12］。在nt303～309 區(qū)域有9 例標本均存在1～3 個堿基C 插入的多態(tài)性改變。nt303～309 區(qū)域是負責RNA-DNA 的形成，從而開始mtDNA 的復(fù)制，這個區(qū)域的一些嚴重突變可能對腫瘤細胞的生長有一定的影響［13］。Maximo V 等［14］檢測突變率分別達50%（15/30）和47.6%（17/36），這些高頻突變反映甲狀腺腫瘤mtDNA 的不穩(wěn)定性。Ding 等［15］在101 例甲狀腺腫瘤（含結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、腺瘤和甲狀腺乳頭狀癌）的檢測中發(fā)現(xiàn)在瘤前病變中突變即存在，并隨腫瘤的發(fā)生而增加。本研究中檢出13 例攜帶mtDNA D-loop 區(qū)點突變，突變率為17.57%（13/74），主要集中在兩個高變區(qū)（HVR-I和HVR-II），其中HVR-II 區(qū)占53.85%（7/13），突變是A-C、T-C 等轉(zhuǎn)換，通常導(dǎo)致其相應(yīng)蛋白質(zhì)的中度或高度保守氨基酸的變化。這些數(shù)據(jù)表明mtDNA突變可能在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤的發(fā)生中起重要作用，鑒于mtDNA 突變存在于良性多結(jié)節(jié)增生中，其可能參與腫瘤發(fā)展的早期階段。

本研究中發(fā)現(xiàn)有5 例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤攜帶異質(zhì)性突變，提示突變細胞具有選擇性生長優(yōu)勢，在腫瘤細胞增殖過程中逐漸在數(shù)量上占優(yōu)。由于mtDNA 分子在細胞內(nèi)的復(fù)制優(yōu)勢，突變可能會被放大，mtDNA 擴增后的細胞由于其克隆生長優(yōu)勢可能會占據(jù)整個種群［16］。通過分析D-loop 區(qū)突變狀態(tài)和臨床病理特征間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)D-loop 區(qū)突變組與非突變組在年齡、性別、是否有家族史、腫瘤大小、以及甲狀腺五項功能檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這可能是腫瘤發(fā)展過程中的一個早期事件，在腫瘤演變的全過程中持續(xù)存在。

綜上所述，本研究確定了D-loop 區(qū)在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤中是一個具有高度多態(tài)性和較高突變率的區(qū)域。雖然，mtDNA D-loop 區(qū)突變和臨床病理參數(shù)間無相關(guān)性，但能夠為mtDNA D-loop 區(qū)突變和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤的發(fā)病機制提供一定的基礎(chǔ)。mtDNA 在腫瘤發(fā)生過程中的變異，有望成為腫瘤診斷、預(yù)后和治療新的靶生物標志物。