丁丹丹，程如玉，韓 瑞，張 姍，丁 翔，王尚華，王倩倩，韓影影，徐錦程

舌鱗狀細胞癌(tongue squamous cell carcinoma, TSCC)是口腔癌中最常見的惡性腫瘤，男、女性均可發(fā)病，其發(fā)病率有逐年上升趨勢，并且發(fā)病年齡年輕化[1]。上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是鱗狀細胞癌浸潤和轉(zhuǎn)移的關鍵機制之一，因此探討TSCC的EMT發(fā)生機制，對于改善預后，提高患者的生存率至關重要。Survivin是迄今為止發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein, IAP)中凋亡抑制作用最強的蛋白，在多種腫瘤組織中高表達，可抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。目前，Survivin與TSCC組織EMT表型的關系尚無相關報道。本文檢測Survivin和EMT相關蛋白E-cadherin和N-cadherin在TSCC中的表達，分析其與臨床病理特征的關系，以期為TSCC的相關機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科2015年1月～2018年12月手術切除且經(jīng)病理確診的TSCC蠟塊標本63例。所有患者均行手術切除，術前未接受放、化療等?；颊吣挲g29～81歲，中位年齡55歲，男性45例，女性18例。腫瘤直徑<2.0 cm者27例，2.0～4.0 cm者23例，>4.0 cm者13例。依據(jù)AJCC(2010年)標準對臨床分期進行劃分，Ⅰ+Ⅱ期37例，Ⅲ+Ⅳ期 26例。根據(jù)WHO(1997)口腔鱗狀細胞癌的分類標準對病理分級進行劃分，Ⅰ級22例，Ⅱ級21例，Ⅲ級20例。發(fā)生區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例，其中有18例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目為1～3枚，6例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目>3枚；未發(fā)生區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例。選取8例符合要求的新鮮TSCC組織標本，取材收集后，即刻轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存。另選擇63例相應癌旁正常上皮組織作為對照組。

1.2 試劑兔抗人Survivin、E-cadherin、N-cadherin抗體購自北京中杉金橋公司；即用型免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色劑及兔抗人β-actin抗體，均購自福州邁新公司；稀釋液及SDS-PAGE電泳試劑盒，均購自北京碧云天公司；PVDF膜購自Millipore公司。

1.3 免疫組化TSCC組織蠟塊標本均制成4 μm厚的切片，免疫組化染色采用EnVision法。一抗用PBS緩沖液代替作為陰性對照，而已知的TSCC組織切片則作為陽性對照。一抗Survivin、E-cadherin及N-cadherin稀釋比均為1 ∶300。

1.4 結(jié)果判定Survivin主要表達于細胞核，E-cadherin主要表達于細胞膜，N-cadherin表達于細胞膜和(或)細胞質(zhì)。按細胞著色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；每例隨機選擇10個熱點區(qū)域的細胞數(shù)，按陽性細胞百分數(shù)計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。將兩項得分結(jié)果相乘：≥3分為陽性，<3 分為陰性。

1.5 Western blot法常規(guī)提取組織中蛋白，采用SDS-PAGE膠電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫浸泡于5%脫脂牛奶中封閉2 h，加入一抗Survivin、E-cadherin、N-cadherin以1 ∶500的比例稀釋，β-actin以1 ∶1 000比例稀釋，4 ℃過夜。次日，TBST洗滌2～3次后孵育二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 1 ∶2 000)2 h，TBST洗滌2～3次。暗室中將混勻的發(fā)光液均勻涂在PVDF膜上，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并通過圖像分析軟件測定各條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計學分析應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗分析Survivin與TSCC臨床病理特征的關系；采用Pearson相關檢驗對Survivin表達與EMT標志蛋白的免疫組化結(jié)果進行相關性分析，采用t檢驗分析統(tǒng)計組間的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin、E-cadherin及N-cadherin在TSCC和癌旁正常上皮組織中的表達免疫組化檢測結(jié)果顯示，TSCC組織中Survivin陽性主要定位于細胞核，E-cadherin陽性主要定位于細胞膜，N-cadherin陽性定位于細胞膜和(或)細胞質(zhì)(圖1～7)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，三者在TSCC和癌旁正常組織中的陽性率組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1)。

2.2 Survivin、E-cadherin及N-cadherin與TSCC臨床病理特征的關系統(tǒng)計結(jié)果顯示，臨床分期及病理分級越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TSCC組織中Survivin陽性率明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其表達與腫瘤直徑、性別、年齡均無關(P>0.05)。E-cadherin和N-cadherin表達與TSCC臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與腫瘤直徑、患者性別及年齡均無關(P>0.05，表2)。Western blot實驗結(jié)果進一步證實與免疫組化結(jié)果一致(圖8)。

圖1 Survivin在癌旁正常上皮組織中的表達,EnVision法圖2 Survivin在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移TSCC組織中的表達,EnVision法 圖3 Survivin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移TSCC組織中的表達,En-Vision法 圖4 E-cadhrin在癌旁正常上皮組織中的表達,EnVision法 圖5 E-cadher-in在TSCC組織中的表達,EnVi-sion法 圖6 N-cadherin在癌旁正常上皮組織中的表達，EnVision法 圖7 N-caderin在TSCC組織中的表達，EnVision法

表1 TSCC和癌旁正常組織中Survivin、E-cadherin和N-cadherin的表達[n(%)]

表2 TSCC中Survivin、E-cadherin、N-cadherin的表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

圖8 Survivin、N-cadherin、E-cadherin在TSCC組織及癌旁正常組織中的表達

2.3 TSCC組織中Survivin與E-cadherin、N-cadherin表達的相關性TSCC組織中E-cadherin和N-cadherin的陽性率分別為42.9%和69.8%。相關性分析顯示，Survivin與E-cadherin的表達呈負相關(r=-0.315，P=0.012)，與N-cadherin的表達呈正相關(r=0.474，P<0.001，表3)。

3 討論

有研究表明，EMT是癌細胞獲得侵襲和遷移能力的首要環(huán)節(jié)[3]。EMT是上皮細胞失去細胞極性和細胞黏附而獲得間質(zhì)特征的可逆過程，其中E-cadherin和N-cadherin是EMT的主要特征性蛋白。當細胞發(fā)生EMT時，表現(xiàn)為上皮性標志物的表達下調(diào)，如E-cadherin；而間質(zhì)型標志物的表達上調(diào)，如N-cadherin[4]。因此，可通過檢測E-cadherin和N-cadherin來鑒定EMT的發(fā)生。本組結(jié)果顯示，E-cadherin在TSCC組織中表達明顯低于癌旁正常組織，且隨著腫瘤臨床分期、病理分級越高，以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目越多，E-cadherin在TSCC組織中的表達越低。N-cadherin在TSCC組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，且隨著腫瘤臨床分期、病理分級越高，以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多，N-cadherin在TSCC組織中的表達越高。

表3 TSCC中Survivin與E-cadherin、N-cadherin表達的相關性

Survivin在多數(shù)腫瘤中過表達，促進腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。Survivin作為節(jié)點蛋白，與參與有絲分裂、凋亡、功能整合增殖、細胞死亡和細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的多種信號相互作用[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)[7-10]，Survivin與胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、子宮頸癌等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有關。本實驗結(jié)果表明，TNM分期越高則Survivin表達越高，病理分級越高則Survivin表達越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Survivin表達越高，提示Survivin表達增強可能對TSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移有重要的促進作用。

有研究表明[11-13]，Survivin對EMT有潛在的誘導作用，從而促進結(jié)腸癌及卵巢癌的轉(zhuǎn)移。本組結(jié)果表明，在TSCC組織中Survivin的表達與E-cadherin呈負相關，與N-cadherin呈正相關，提示Survivin可能作為誘導EMT進程的誘因之一，參與多種信號通路(TGFb、ERK1/2、P13K/AKT)促進癌細胞EMT的發(fā)生[14]。本組僅在組織水平驗證Survivin與EMT在TSCC組織中的表達水平及相關性分析，而Survivin是通過何種途徑調(diào)控TSCC組織EMT的發(fā)生需更深入的探討。