喻 宏，孫 炎，李曉星，茍繼周，羅偉仁

腎穿刺活檢組織病理診斷是腎臟疾病診斷以及鑒別的重要方法，包括常規(guī)HE染色、特殊染色、免疫熒光染色及電鏡檢查等。其中，特殊染色是腎穿刺活檢組織的重要輔助檢查方法，主要包括PAS染色、PASM染色、Masson染色以及剛果紅染色等。在日常工作中，如果對(duì)穿刺腎組織分別進(jìn)行染色，所需時(shí)間長(zhǎng)，工作量大，不利于病理醫(yī)師鏡下觀察免疫復(fù)合物沉積及其位置[1]。相反，PASM-Masson套染能夠在同一張切片中準(zhǔn)確顯示病變腎小球內(nèi)各種免疫復(fù)合物的形態(tài)與定位，明顯縮短了染色時(shí)間，提高了工作效率，對(duì)診斷腎小球疾病起重要作用[2]。

1 材料與方法

1.1 材料收集2018年1～12月深圳市第三人民醫(yī)院(南方科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院)病理科存檔的腎穿刺活檢標(biāo)本109例，組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定(pH 7.0)，固定時(shí)間12～24 h。常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋后，切片。切片厚1.5 μm，70 ℃烤箱烤片40 min。

1.2 試劑Bouin固定液(飽和苦味酸 ∶甲醛 ∶冰醋酸=15 ∶5 ∶1)，購(gòu)自廣州凱秀貿(mào)易公司。Masson試劑盒(包括鐵蘇木精、麗春紅酸性品紅工作液、苯胺藍(lán)、磷鉬酸)，購(gòu)自廣州維格斯公司。六胺銀染色試劑盒(高碘酸、硼砂溶液、硝酸銀六次甲基四胺粉劑)，購(gòu)自珠海貝索(BASO)公司。

1.3 染色方法將腎穿刺組織石蠟包埋后，1.5 μm厚切片，70 ℃烤片40 min。切片入二甲苯脫蠟梯度乙醇入水，1%高碘酸氧化30 min，蒸餾水沖洗。切片置于六胺銀工作液35 min(60 ℃水浴箱孵育)，觀察切片呈金黃色，終止染色，蒸餾水沖洗。0.1%氯化金脫色數(shù)秒，鏡下觀察至金黃色消失，基膜呈明顯黑色，蒸餾水沖洗。3%硫代硫酸鈉定影1 min，蒸餾水沖洗。Bouin液補(bǔ)充固定(37 ℃水浴箱4 h)。鐵蘇木精15 min，熱水藍(lán)化30 s。蒸餾水沖洗，Masson液30 min，蒸餾水沖洗。1%磷鉬酸分化5 min，不用水洗，直接甩掉磷鉬酸后加入1%苯胺藍(lán)5 min。蒸餾水沖洗，加入1%醋酸分化2 min。高濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2 結(jié)果

PASM-Masson套染結(jié)果顯示，切片背景干凈，結(jié)構(gòu)清晰，腎小球基膜、腎小管基膜和毛細(xì)血管基膜均呈黑色或棕黑色，細(xì)胞間質(zhì)以及膠原纖維呈藍(lán)黑色，紅細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及免疫復(fù)合物呈紅色(圖1、2)。

圖1 膜性腎小球腎炎(3期)：腎小球毛細(xì)血管袢基膜外側(cè)見大量“釘突”形成(箭頭)；基膜呈黑色，免疫復(fù)合物“釘突”呈紅色

圖2 糖尿病腎?。好?xì)血管基膜呈黑色，系膜細(xì)胞間質(zhì)以及膠原纖維增生呈藍(lán)黑色(箭頭)

3 討論

特殊染色是鑒別腎臟疾病，顯示腎組織內(nèi)某些特殊成分的重要方法[3]。PASM染色法主要是觀察腎穿刺組織中腎小球基膜、毛細(xì)血管袢基膜的病變程度，Masson染色主要是觀察腎小球內(nèi)免疫復(fù)合物沉積、系膜基質(zhì)、基膜及腎間質(zhì)膠原纖維增生程度。在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，如僅單獨(dú)對(duì)腎穿刺組織進(jìn)行PASM染色或Masson染色，很難對(duì)基膜病變與免疫復(fù)合物病變進(jìn)行準(zhǔn)確定位，不利于判斷兩者是否存在于同一部位。PASM-Masson套染既可以顯示腎小球毛細(xì)血管和腎小囊基膜在炎性損傷中的改變細(xì)節(jié)，也可以觀察免疫復(fù)合物的沉積[4]。實(shí)際操作中常規(guī)的六胺銀染色背景過深，Masson染色對(duì)腎小球內(nèi)的免疫復(fù)合物顯色淡，基膜和膠原纖維對(duì)比不清晰。我科通過采取延長(zhǎng)高碘酸氧化時(shí)間至30 min，充分暴露基膜內(nèi)黏多糖中的醛基，加深金屬銀的顯色對(duì)比度；之后Masson染色用Bouins液補(bǔ)充固定，一方面固定液中的苦味酸可軟化過硬的纖維組織，使麗春紅等大分子染料能穿透進(jìn)入，另一方面使之pH環(huán)境降低，讓膠原纖維、紅細(xì)胞、免疫復(fù)合物著色鮮艷，與基膜著色對(duì)比清晰。

作者在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，切片厚度以1～1.5 μm效果最好。切片太厚(3 μm以上)，不宜觀察基膜病變的組織和結(jié)構(gòu)，如腎小球結(jié)構(gòu)不清楚，“釘突”病變結(jié)構(gòu)顯示變得模糊。在PASM-Masson套染過程中，Bouins液、六胺銀工作液及Masson液溫度可自行調(diào)節(jié)，浸染效果更方便把控。此外，需控制PASM工作液和Masson液染色時(shí)間，每個(gè)步驟結(jié)束均需鏡下觀察染色程度及時(shí)進(jìn)行調(diào)節(jié)。如PASM染色需要微鏡下觀察到腎小球基膜的著色，背景無明顯著色即可終止。不宜著色過深，否則會(huì)影響后續(xù)的染色并人為增加基膜的非特異性著色。另外，高濃度乙醇脫水耗時(shí)較少，耗時(shí)較多則會(huì)導(dǎo)致Masson脫色。Masson染色淺染或過染均可以原步驟返回重新染色。

經(jīng)本科室改良的PASM-Masson套染，對(duì)病變定位準(zhǔn)確、背景清晰，對(duì)比明顯，有利于病理醫(yī)師觀察腎小球基膜病變及免疫復(fù)合物的定位。此外，套染方法快速、簡(jiǎn)便，可以減少染色時(shí)間，提高工作效率，具有一定的臨床診斷應(yīng)用價(jià)值。