田 靜，李學(xué)敏，吳莉莉，代 群，張 湛

2018年全球新增胃癌患者約100萬(wàn)人，死亡約78.3萬(wàn)人[1]，其中中國(guó)至少有一半的新發(fā)胃癌患者和死亡病例[2]。胃腺癌約占胃癌總數(shù)的90%[3]。WW結(jié)構(gòu)域氧化還原酶(WW domain-containing oxidoreductase, WWOX)最初是在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。WWOX基因的突變方式主要為半合子和純合子缺失[4]，導(dǎo)致其表達(dá)異常降低，與腫瘤組織的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等密切相關(guān)[5-6]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSC)是指一小群具有自我更新、不對(duì)稱分裂及誘導(dǎo)分化、侵襲、轉(zhuǎn)移及抵抗放、化療的細(xì)胞[7]。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G亞家族成員2(ATP-binding cassette sub-family G member 2, ABCG2)是三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族重要成員，可以促進(jìn)CSC的側(cè)群細(xì)胞形成[8]。目前，關(guān)于WWOX和ABCG2的關(guān)系尚未見報(bào)道。本文主要通過(guò)免疫組化EnVision法檢測(cè)112例胃腺癌組織中WWOX和ABCG2蛋白的表達(dá)，分析其與胃腺癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2010年1月～2018年12月合肥第三人民醫(yī)院病理科和肥西縣人民醫(yī)院病理科胃腺癌組織標(biāo)本112例(術(shù)前未行任何抗腫瘤治療)和相應(yīng)的癌旁(>5.0 cm)正常胃黏膜組織60例作為對(duì)照。所有胃腺癌患者均有完善的臨床病理資料和隨訪資料，入選病例隨訪至患者死亡或截止2019年3月。隨訪時(shí)間4～83個(gè)月，中位時(shí)間為49.1個(gè)月。年齡28～75歲，中位年齡55.3歲。

1.2 試劑兔抗人多克隆抗體WWOX和鼠抗人單克隆抗體ABCG2，均購(gòu)自美國(guó)Abcam生物公司；EnVision和DAB顯色試劑盒，均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚切片，在二甲苯及梯度乙醇溶液中連續(xù)脫蠟至水洗。WWOX和ABCG2蛋白的染色步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，采用PBS液代替一抗作空白對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定WWOX主要以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性，細(xì)胞膜也可以著色；ABCG2主要以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性。陽(yáng)性判定主要根據(jù)免疫組化染色的著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)乘積計(jì)分[9]，若乘積≥3分判定為陽(yáng)性，<3分判定為陰性。免疫組化染色結(jié)果判定由兩位高年資病理醫(yī)師通過(guò)雙盲法獨(dú)立閱片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。WWOX和ABCG2蛋白表達(dá)與胃腺癌中臨床病理參數(shù)及相關(guān)性采用χ2、Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)；應(yīng)用Kaplan-Meier法分析WWOX和ABCG2陽(yáng)性組和陰性組患者術(shù)后總生存時(shí)間，組間比較采用Log-rank法檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌中WWOX蛋白表達(dá)WWOX蛋白在對(duì)照組中的陽(yáng)性率為91.7%(55/60)，在胃腺癌組中的陽(yáng)性率為42.0%(47/112)，WWOX蛋白的表達(dá)差異在兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖1A、B)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著胃腺癌組織的分化越差、TNM分期越高，WWOX蛋白的陽(yáng)性率越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中WWOX的陽(yáng)性率顯著低于淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移組。WWOX蛋白的表達(dá)與胃腺癌患者年齡、腫瘤位置、大體類型、大小及吸煙和飲酒，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

2.2 胃腺癌中ABCG2蛋白的表達(dá)ABCG2蛋白在對(duì)照組中的陽(yáng)性率為8.3%(5/60)，在胃腺癌組中的陽(yáng)性率為59.8%(67/112)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1C、D)。ABCG2蛋白表達(dá)與胃腺癌患者性別、年齡、腫瘤位置、大體類型、大小及吸煙和飲酒，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。隨著胃腺癌組織的分化越差，ABCG2蛋白的陽(yáng)性率越高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中ABCG2蛋白的陽(yáng)性率顯著高于淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移組；TNM高分期組中的ABCG2蛋白的陽(yáng)性率顯著高于TNM低分期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

圖1 A. WWOX在對(duì)照組中呈陽(yáng)性，EnVision法；B. WWOX在胃腺癌中呈陰性，EnVision法；C. ABCG2在對(duì)照組中呈陰性，EnVision法；D.ABCG2在胃腺癌中呈陽(yáng)性，EnVision法

2.3 WWOX和ABCG2蛋白表達(dá)的相關(guān)性Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，在胃腺癌組中WWOX與ABCG2蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.558，P<0.001，表2)。

2.4 Cox多因素回歸分析將胃腺癌患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置、大體類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、WWOX、ABCG2、吸煙以及飲酒等因素，經(jīng)Cox多因素回歸模型分析：WWOX和ABCG2蛋白的表達(dá)及TNM分期是影響胃腺癌患者術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素(表3)。

2.5 生存分析本組經(jīng)Kaplan-Meier生存分析顯示，WWOX蛋白陽(yáng)性組與陰性組的中位生存時(shí)間分別為(66.2±16.4)個(gè)月和(36.7±18.9)個(gè)月，Log-rank分析兩組總生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖2A)；ABCG2蛋白陽(yáng)性組與陰性組患者的中位生存時(shí)間分別為(67.4±15.0)個(gè)月和(36.8±18.9)個(gè)月。Log-rank分析兩組總生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖2B)。

表1 WWOX和ABCG2蛋白表達(dá)與胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系

表2 WWOX和ABCG2蛋白表達(dá)的相關(guān)性

表3 胃腺癌患者的多因素分析

圖2 胃腺癌患者生存曲線: A.WWOX表達(dá)與胃腺癌患者預(yù)后的關(guān)系；B.ABCG2表達(dá)與胃腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

盡管各種新的治療手段(如靶向治療、免疫治療等)在一定程度改善胃腺癌患者的預(yù)后，但胃腺癌患者術(shù)后總生存時(shí)間并未顯著延長(zhǎng)。因此，需尋找能夠預(yù)測(cè)胃腺癌患者浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的標(biāo)志物。抑癌基因的表達(dá)異常降低或缺失是腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。WWOX又叫脆性位點(diǎn)FRA16D氧化還原酶，是近年才發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。WWOX基因定位于人染色體16q23.3-24.1，含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，編碼長(zhǎng)度為414個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。眾多的研究表明，WWOX基因可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及促進(jìn)凋亡[10-11]。WWOX在正常組織中廣泛表達(dá)，其在多種腫瘤組織中主要表現(xiàn)為半盒子和純合子缺失，導(dǎo)致其表達(dá)降低或缺失。本組采用免疫組化EnVision法檢測(cè)WWOX蛋白在胃腺癌組及對(duì)照組中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在胃腺癌組中WWOX蛋白的陽(yáng)性率顯著低于其在對(duì)照組中的陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著胃腺癌分化越差，WWOX蛋白陽(yáng)性率越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中WWOX蛋白的陽(yáng)性率也顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性率；TNM分期越高，WWOX蛋白的陽(yáng)性率也越低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明，WWOX蛋白表達(dá)的異常降低或缺失可能促進(jìn)胃腺癌的增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，該結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[4-6,12]。

ABCG2是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族重要成員之一，該家族成員屬于跨膜蛋白，最先在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中發(fā)現(xiàn)，能夠抵抗部分化療藥物的抗腫瘤作用，主要通過(guò)其位于細(xì)胞膜上的泵將細(xì)胞內(nèi)的抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。ABCG2能通過(guò)泵將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的形成[13]。眾多研究表明，ABCG2表達(dá)異常增高，常常意味著腫瘤患者術(shù)后易于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，且預(yù)后較差[14]。2012年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ABCG2表達(dá)增強(qiáng)能夠促進(jìn)CSC中的SP細(xì)胞形成，隨后在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)相似作用，因此認(rèn)為ABCG2是一個(gè)新的CSC標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ABCG2蛋白在胃腺癌陽(yáng)性率顯著高于其在對(duì)照組中的陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著胃腺癌組織分化越差，ABCG2蛋白的陽(yáng)性率越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中ABCG2蛋白的陽(yáng)性率也顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性率；TNM分期越高，ABCG2蛋白的陽(yáng)性率也越高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明，ABCG2蛋白表達(dá)的異常增高可能參與胃腺癌的發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等過(guò)程，與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[7-10]。

目前，根據(jù)患者TNM分期制定治療策略的原則已被廣泛接受，但是由于腫瘤的異質(zhì)性和演進(jìn)，TNM分期難以完全反應(yīng)每個(gè)腫瘤患者的具體生物學(xué)特性。因此，迫切需要找到能夠預(yù)測(cè)每個(gè)腫瘤的生物學(xué)行為的標(biāo)記。ABCG2蛋白陽(yáng)性組患者術(shù)后總生存時(shí)間明顯低于其陰性組；WWOX蛋白陽(yáng)性組患者的術(shù)后總生存時(shí)間明顯高于其陰性組，Log-rank分析表明差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素分析表明WWOX和ABCG2蛋白陽(yáng)性以及TNM分期是影響胃腺癌患者術(shù)后生存的獨(dú)立預(yù)后因素。Spearman相關(guān)分析顯示W(wǎng)WOX和ABCG2蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。于小棠等[15]通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染增強(qiáng)WWOX的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)WWOX能夠抑制CSC的干性，包括自我更新能力、分化潛能、體內(nèi)致瘤能力、干細(xì)胞基因的高水平表達(dá)和多藥耐藥性。Li等[16]通過(guò)基因沉默技術(shù)降低WWOX的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)WWOX可能通過(guò)Hippo、MAPK以及TGF-β等信號(hào)通路調(diào)節(jié)CSC的干性。表達(dá)異常增高的ABCG2可能參與胃腺癌的發(fā)生，并進(jìn)一步促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。與此同時(shí)，表達(dá)降低或缺失的WWOX蛋白喪失其抑制CSC的自我更新及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的能力[13,15]，進(jìn)一步促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，且ABCG2高表達(dá)和WWOX的低表達(dá)提示患者預(yù)后差。

綜上所述，異常表達(dá)的ABCG2蛋白參與胃腺癌發(fā)生，可能與表達(dá)降低的WWOX協(xié)同促進(jìn)胃腺癌的增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等過(guò)程。因此，在胃腺癌患者腫瘤組織中早期聯(lián)合檢測(cè)ABCG2和WWOX蛋白的表達(dá)，可作為預(yù)測(cè)胃腺癌患者術(shù)后浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的候選指標(biāo)之一。