楊 帆，申國(guó)文，周 晨，楊 揚(yáng)，段晶玲，肖勝軍，張小玲

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤，2018年全球甲狀腺癌發(fā)病人數(shù)約56.7萬(wàn)，約占所有癌癥發(fā)病的3%[1]。甲狀腺癌的主要組織學(xué)類型包括乳頭狀癌、濾泡癌、髓樣癌和未 分化癌[2]，其中乳頭狀癌發(fā)病率最高，占所有甲狀腺癌的70%以上[3]。近年甲狀腺癌發(fā)生率在全球范圍內(nèi)快速上升[4]。

端粒鋅指相關(guān)蛋白(telomeric zinc finger-associated protein, TZAP)是由ZBTB48基因編碼的蛋白。TZAP蛋白通過(guò)直接結(jié)合端粒DNA雙鏈的TTAGGG重復(fù)序列，負(fù)性調(diào)控端粒長(zhǎng)度，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[5]。此外，TZAP還可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能，促進(jìn)p14ARF的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[6]。TZAP與端粒相關(guān)疾病密切相關(guān)，然而在腫瘤中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道[7]。本文采用免疫組化EnVision法檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌及癌旁正常組織中TZAP的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，探討TZAP在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年1月～2017年12月桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院存檔的71例甲狀腺乳頭狀癌組織納入觀察，納入條件：取患者未行放、化療及免疫治療時(shí)的手術(shù)切除標(biāo)本；術(shù)后病理確診為甲狀腺乳頭狀癌，不考慮腫瘤大小或是否轉(zhuǎn)移；本實(shí)驗(yàn)經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不完整者；合并其他惡性腫瘤、自身免疫性疾病等。

1.2 免疫組化采用免疫組化EnVision法染色，手術(shù)標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，4 μm厚切片，二甲苯脫蠟至水，流水沖洗10 min，檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓修復(fù)3 min，室溫下自然冷卻后，3%雙氧水孵育10 min，PBS沖洗3次×3 min，TZAP兔多克隆抗體(AB_2649779，上海賽默飛科技)(1 ∶100稀釋)4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗3次×3min，二抗(KIT-5220，福州邁新公司)37 ℃孵育30 min，DAB顯色5 min。蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹脂封固。

1.3 結(jié)果判讀TZAP表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，呈黃色或棕黃色顆粒。按陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～75%為2分，>75%為3分；兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘為最后得分：0分為陰性，其余為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，甲狀腺乳頭狀癌和癌旁正常組織細(xì)胞核中TZAP的表達(dá)差異用Pearson χ2檢驗(yàn)分析；TZAP核表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TZAP蛋白在甲狀腺乳頭狀癌及癌旁正常組織中的表達(dá)TZAP蛋白在癌旁正常組織的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均為陽(yáng)性(71/71，100%)；與癌旁正常組織相比(圖1)，TZAP在甲狀腺乳頭狀癌組織的細(xì)胞核中表達(dá)下調(diào)(圖2、3)，甲狀腺乳頭狀癌中TZAP細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性率為100%(71/71)，細(xì)胞核陽(yáng)性率為52.11%(37/71)，兩者表達(dá)差異有顯著性(χ2=42.113，P<0.001)。

圖1 癌旁正常組織濾泡上皮中TZAP呈細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核陽(yáng)性，EnVision法 圖2 甲狀腺乳頭狀癌組織中TZAP呈細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核陽(yáng)性，EnVision法

圖3 甲狀腺乳頭狀癌組織中TZAP呈細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性，細(xì)胞核陰性，EnVision法

2.2 TZAP蛋白表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的相關(guān)性TZAP蛋白表達(dá)與腫瘤大小(rs=-0.249，P=0.036)、TNM分期(rs=0.264，P=0.026)呈負(fù)相關(guān)；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(rs=-0.356，P=0.002)、甲狀腺外播散(rs=-0.250，P=0.035)呈正相關(guān)；腫瘤直徑≥1 cm、有甲狀腺外播散、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期較高者TZAP陰性率較高(表1)。與患者年齡(P=0.421)、性別(P=0.892)、多灶性(P=0.206)及是否伴有橋本甲狀腺炎(P=0.459)無(wú)相關(guān)性(表1)。

表1 甲狀腺乳頭狀癌中TAZP蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n (%)]

3 討論

TZAP是端粒鋅指結(jié)合蛋白，由ZBTB48基因編碼，在染色體上定位于1p36。TAZP蛋白含有688個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為7.7×104，在羧基端含有11個(gè)C2H2類型的鋅指結(jié)構(gòu)，氨基端高度保守，在其氨基末端保守區(qū)與鋅指結(jié)構(gòu)域之間存在呈酸性的反式激活區(qū)[8]。ZBTB48基因所在的染色體區(qū)域在多個(gè)人類惡性腫瘤中出現(xiàn)異常，包括重組(平滑肌瘤、白血病等)或刪失(神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌等)[5]，提示該基因可能是潛在的抑癌基因[9]。

TZAP可以直接結(jié)合到端粒的TTAGGG重復(fù)序列，可以觸發(fā)“端粒修剪”，導(dǎo)致端粒重復(fù)片段的刪除，使端粒長(zhǎng)度變短[10]。端?？s短能限制干細(xì)胞的復(fù)制能力[11]，調(diào)控細(xì)胞永生化和衰老之間的平衡，這些分子事件的調(diào)控異常都被認(rèn)為是癌癥相關(guān)的關(guān)鍵分子事件[12]。以上數(shù)據(jù)提示TZAP對(duì)端粒的調(diào)控可能參與腫瘤的發(fā)生。

此外，TZAP也能作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄。TAZP能結(jié)合CDKN2A近端啟動(dòng)子區(qū)域，激活其轉(zhuǎn)錄本ARF的表達(dá)，促進(jìn)p14ARF蛋白的表達(dá)[6]。p14ARF能直接抑制細(xì)胞周期進(jìn)展[13]，還能通過(guò)p53信號(hào)通路(ARF-MDM2-TP53-p21WAF/CDKN1A)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，TZAP能通過(guò)對(duì)端粒、細(xì)胞增殖和凋亡等的調(diào)控發(fā)揮抑癌作用。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化EnVision法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺乳頭狀癌組織中，細(xì)胞核內(nèi)TZAP表達(dá)下調(diào)，且其下調(diào)與進(jìn)展期臨床病理特征相關(guān)(包括腫瘤體積大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外播散、臨床進(jìn)展期)；提示TZAP可能參與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展，其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步分析。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)TZAP表達(dá)無(wú)明確下調(diào)，提示胞質(zhì)內(nèi)TZAP可能具有與核內(nèi)TZAP不同的功能。Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)TZAP蛋白除經(jīng)典的7.7×104異構(gòu)體外，還有4個(gè)潛在的小分子量的異構(gòu)體，氨基酸長(zhǎng)度128～310 aa(https://www.uniprot.org/uniprot/P10074#sequences)。不同的異構(gòu)體可能存在不同的亞細(xì)胞定位和功能，提示核內(nèi)定位的異構(gòu)體具有抑瘤作用，而非胞質(zhì)內(nèi)異構(gòu)體。不同剪切異構(gòu)體在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及功能，有待于后續(xù)進(jìn)一步分析。

總之，甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞核內(nèi)TZAP表達(dá)下調(diào)，可能參與其發(fā)生、發(fā)展。