趙挺祺，李時(shí)榮，王靜媛，韓希然，胡飄飄，烏云嘎，徐曉艷

近年肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移、生長及預(yù)后的相關(guān)基因成為研究熱點(diǎn)，LASS2/TMSG1基因是新發(fā)現(xiàn)的抑制腫瘤生長、侵襲的指標(biāo)。馬春樹等[1]從前列腺癌細(xì)胞中分離出TMSG1基因；上海復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所克隆出LASS2與TMSG1高度同源[2]，因此稱該基因?yàn)長ASS2/TMSG1基因。目前發(fā)現(xiàn)LASS2/TMSG1過表達(dá)可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡并抑制其侵襲，如前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等[3-8]；但在肺癌中關(guān)于LASS2/TMSG1的報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法檢測(cè)LASS2/TMSG1在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的表達(dá)，分析LASS2/TMSG1的表達(dá)與肺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2014年1月1日～2016年12月31日內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)切除經(jīng)病理診斷為NSCLC標(biāo)本87例，其中男性55例，女性32例，平均年齡(58.32±4.58)歲；同時(shí)收集癌旁正常組織25例，其中男性15例，女性10例，平均年齡(58.69±6.41)歲。患者均有完整的臨床資料，術(shù)前均未接受放、化療。組織學(xué)分級(jí)：鱗癌43例、腺癌27例、其他類型癌17例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例(送檢淋巴結(jié)證實(shí)至少1枚淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移)。對(duì)所有病例進(jìn)行電話隨訪，截止日期為2018年11月，其中25例失訪。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行常規(guī)HE染色。采用免疫組化SP法染色，實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽性切片作為陽性對(duì)照。兔抗人Anti-LASS2多克隆抗體購自Abcam公司，SP超敏試劑盒(鼠/兔)、DAB顯色試劑盒，均購自北京博奧森公司。

1.3 結(jié)果判定LASS2/TMSG1以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)顯示棕色顆粒作為蛋白陽性。進(jìn)行半定量積分判斷：按陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計(jì)分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～4分為陰性(-)，5～12分為陽性(+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組率的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。采用Log-rank法進(jìn)行生存曲線的比較；預(yù)后影響因素采用Cox回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LASS2/TMSG1在NSCLC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)NSCLC組織和癌旁正常組織中LASS2/TMSG1定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)(圖1)。LASS2/TMSG1在NSCLC組織和癌旁正常組織中的陽性率分別為24.13%(21/87)和60.00%(15/25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 NSCLC和癌旁正常組織中LASS2/TMSG1的表達(dá)

2.2 LASS2/TMSG1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系Spearman相關(guān)分析顯示，NSCLC中LASS2/TMSG1蛋白表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、是否吸煙、民族無相關(guān)性(P>0.05)。LASS2/TMSG1表達(dá)與組織學(xué)類型相關(guān)，LASS2/TMSG1蛋白在腺癌中的表達(dá)高于鱗癌(表2)。

圖1 LASS2/TMSG1在NSCLC組織及癌旁正常組織中的表達(dá)：A.鱗癌及癌旁正常組織中LASS2/TMSG1的表達(dá)，SP法；B.腺癌及癌旁正常組織中LASS2/TMSG1的表達(dá)，SP法；C.鱗癌(癌團(tuán))及癌旁正常組織(正常支氣管組織)；D.腺癌(細(xì)胞復(fù)層有異型)及癌旁正常組織(可見纖毛)

2.3 LASS2/TMSG1蛋白表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

2.3.1總生存期 本組87例患者中52例獲得隨訪資料，生存時(shí)間3～36個(gè)月，平均生存時(shí)間21.25個(gè)月。

2.3.2LASS2/TMSG1表達(dá)與NSCLC患者生存率的關(guān)系 LASS2/TMSG1陽性組和陰性組平均生存時(shí)間分別為27.52、20.26個(gè)月，中位生存時(shí)間為30.00和18.00個(gè)月。Log-rank法比較兩組生存率差異有顯著性(χ2=6.237，P=0.013)，LASS2/TMSG1陽性組的生存率明顯高于陰性組(圖2)。

圖2 LASS2/TMSG1表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

表2 LASS2/TMSG1蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3.3Cox多因素回歸分析 本組對(duì)NSCLC患者性別、年齡、民族、是否吸煙、腫瘤大小、組織學(xué)類型、病理分級(jí)、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LASS2/TMSG1的表達(dá)，經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示：患者性別、年齡、民族、是否吸煙、腫瘤大小、組織學(xué)分型均與NSCLC的預(yù)后無關(guān)(P>0.05)；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LASS2/TMSG1陽性與NSCLC的預(yù)后有關(guān)(HR=1.621，P=0.01；HR=0.598，P=0.002)，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LASS2/TMSG1陰性的NSCLC患者預(yù)后較差。

3 討論

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，NSCLC占肺癌患者總數(shù)的85%，并且其發(fā)病率和病死率逐年上升[9-10]。肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多因素、多步驟和多基因參與的復(fù)雜過程。在此期間，癌癥相關(guān)基因的激活、失活和分子突變等分子病理變化導(dǎo)致一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，貫穿整個(gè)肺癌病變的過程。

最新發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因LASS2/TMSG1，對(duì)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖及凋亡等過程有一定的調(diào)控作用。Xu等[11]利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法沉默PC-3M-2B4(低轉(zhuǎn)移潛能)細(xì)胞中的LASS2/TMSG1基因，結(jié)果顯示LASS2/TMSG1基因的沉默對(duì)PC-3M-2B4細(xì)胞的惡性進(jìn)程起促進(jìn)作用。徐曉艷等[12]利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法過表達(dá)95D細(xì)胞中的LASS2/TMSG1基因，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LASS2/TMSG1基因抑制肺癌細(xì)胞95D的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。左華楚等[13]在肺癌細(xì)胞系95C細(xì)胞中通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染沉默LASS2/TMSG1基因，發(fā)現(xiàn)其能夠明顯增強(qiáng)肺細(xì)胞腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。上述報(bào)道提示LASS2/TMSG1基因?qū)儆谀[瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。

本實(shí)驗(yàn)主要采用免疫組化SP法檢測(cè)NSCLC中LASS2/TMSG1蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LASS2/TMSG1在NSCLC組織的陽性率低于癌旁正常組織，說明在NSCLC的發(fā)生過程中LASS2/TMSG1可能起抑癌作用。進(jìn)一步分析LASS2/TMSG1蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LASS2/TMSG1蛋白陽性率與分化程度、組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、是否吸煙、民族無關(guān)。劉博等[14]發(fā)現(xiàn)在腫瘤分化程度低、TNM分期高、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者TMSG1的表達(dá)低。譚真等[15]發(fā)現(xiàn)LASS2/TMSG1蛋白表達(dá)與肺腺癌患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)；與浸潤性腺癌亞型關(guān)系密切；淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組與有轉(zhuǎn)移組相比，LASS2/TMSG1表達(dá)明顯增強(qiáng)。上述結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示LASS2/TMSG1與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等呈顯著的負(fù)相關(guān)。

本組隨訪病例中LASS2/TMSG1陰性組患者的生存率均明顯低于陽性組。此外，本組經(jīng)Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)患者性別、年齡、民族、是否吸煙、腫瘤大小、組織學(xué)分類均與NSCLC的預(yù)后無關(guān)；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LASS2/TMSG1的表達(dá)有關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者死亡風(fēng)險(xiǎn)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比，增加1.578倍；LASS2/TMSG1陰性者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是陽性者的0.625倍。由此可見，LASS2/TMSG1陽性率越低，NSCLC患者預(yù)后越差。進(jìn)一步證明，LASS2/TMSG1的表達(dá)可作為肺癌預(yù)后的可靠標(biāo)志物，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14-15]，尤其在腫瘤的早期階段是一個(gè)非常重要的預(yù)后參考指標(biāo)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LASS2/TMSG1在NSCLC中的陽性率低于癌旁正常組織，LASS2/TMSG1蛋白表達(dá)與分化程度、組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)LASS2/TMSG1表達(dá)與NSCLC的發(fā)生、進(jìn)展、浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，為肺癌的臨床預(yù)防、治療提供依據(jù)。由于本實(shí)驗(yàn)樣本量較少，尚需積累大樣本前瞻性的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，LASS2/TMSG1有望成為治療肺癌浸潤、轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。