周成友，杜 陽，趙 靜，李 良

子宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，在發(fā)展中國家的發(fā)病率較高[1]。近年子宮頸癌的發(fā)病趨勢逐漸年輕化，且早期無明顯體征，病變發(fā)展至晚期全身會出現(xiàn)衰竭癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此有效的早期篩查和診斷危險因素可預(yù)防子宮頸癌變，并為后期及時治療提供依據(jù)[2]。Survivin是位于17號染色體q25區(qū)的生存素，眾多學(xué)者認(rèn)為其有望成為腫瘤治療的靶點[3]；miRNA是一類長約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，參與生物體細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等多種關(guān)鍵調(diào)控，其異常表達(dá)與子宮頸癌、卵巢癌等婦科腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。目前，miRNA具體作用機(jī)制尚未明確[6]。miR-153和Survivin在子宮頸癌組織中的作用機(jī)制及相關(guān)性尚未見報道，本實驗檢測子宮頸癌和正常子宮頸組織中miR-153、Survivin的相對表達(dá)量，分析兩者之間的關(guān)系及其與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，為子宮頸癌分子篩查、診斷、治療及預(yù)后評估提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集2011年1月～2016年1月在我院行手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的50例子宮頸癌組織標(biāo)本，患者年齡30～71歲，平均(50.40±12.23)歲；按2018國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)分期：Ⅰ期7例，ⅡA期6例，ⅡB期13例，Ⅲ期24例；腫瘤直徑≥4 cm者30例，<4 cm者20例；腫瘤類型：內(nèi)生結(jié)節(jié)型27例，菜花型23例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者17例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例。另選取40例因子宮肌瘤行子宮切除患者的正常子宮頸組織作為對照組，患者年齡30～73歲，平均(49.10±13.06)歲。兩組患者臨床資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)組織活檢及術(shù)后病理檢查確診為子宮頸癌患者，且均確診為鱗癌；(2)術(shù)前均未服用抗腫瘤藥物或接受任何放、化療患者；(3)病理和隨訪資料完整者；(4)均未合并其他腫瘤或癌前病變者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝、腎等重要器官功能嚴(yán)重不全者；(2)合并其他惡性腫瘤或感染性疾病者；(3)非HPV病毒感染的子宮頸癌患者；(4)術(shù)后3年內(nèi)失訪者。

1.2 主要試劑All-in-one miRNA qRT-PCR Detection Kit 試劑盒、PCR引物，均購自奧科生物公司；Recover All Total Nucleic Acid Isilation Kit for FF-PE脫蠟試劑盒，購自Thermo fisher SCIENTIFIC公司；兔抗人Survivin多克隆抗體，購自北京中杉金橋公司；PBS溶液，購自北京中杉金橋公司；二氨基聯(lián)苯胺顯色劑及載玻片，均購自武漢博士德公司。

1.3 方法

1.3.1RT-PCR 采用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染效果，Trizol法提取組織中的總RNA，按照RecoverAll Total Nucleic Acid Isilation Kit for FF-PE脫蠟試劑盒說明書步驟提取核酸，按All-in-one miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒說明書步驟制備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。所有引物均由奧科生物公司設(shè)計合成，用2-ΔΔCt法計算miR-153的相對表達(dá)量。

1.3.2免疫組化 采用免疫組化SP法染色，取各組標(biāo)本制作石蠟切片，按常規(guī)方法脫蠟、包埋、切片。將切片置于0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)中加熱修復(fù)抗原15 min，取出用0.01 mol/L PBS溶液沖洗3次；加入3%過氧化氫溶液孵育25 min，再用PBS溶液沖洗5次；加入5%山羊血清，室溫封閉10 min，滴加Survivin一抗置于4 ℃冰箱中過夜；次日PBS沖洗3次，滴加Survivin二抗室溫孵育30 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵蛋白工作液孵育30 min，PBS沖洗3次。二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明和封固，置于鏡下觀察。另以空白PBS液作陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷隨機(jī)觀察每張切片10個高倍鏡下不重復(fù)視野，根據(jù)細(xì)胞染色程度和染色細(xì)胞的百分率進(jìn)行綜合評分。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計分：無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；根據(jù)陽性細(xì)胞百分率計分：<10%為0分，10%～40%為1分，41%～70%為2分，>70%為3分；將上述兩項得分相加：總分≥2分為高表達(dá)，反之為低表達(dá)。

1.5 隨訪對子宮頸癌患者隨訪3年，在我院長期治療的患者復(fù)查詳細(xì)病理資料，未在本院進(jìn)行復(fù)查的患者采用電話隨訪進(jìn)行聯(lián)系，主要記錄分析對象的總生存時間。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌和正常子宮頸組織中miR-153、Survivin的表達(dá)本組結(jié)果顯示：miR-153在子宮頸癌組織中的相對表達(dá)量明顯低于正常子宮頸組織，而Survivin在子宮頸癌組織中的相對表達(dá)量明顯高于正常子宮頸組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.333、t=6.407，P均<0.01，表1)；免疫組化染色可見Survivin蛋白表達(dá)主要位于基底層細(xì)胞(圖1)；通過散點圖及相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)子宮頸癌組織中miR-153和Survivin的相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

表1 子宮頸癌和正常子宮頸組織中miR-153、Survivin的表達(dá)

圖1 A.子宮頸癌組織中Survivin的表達(dá)，SP法；B.正常子宮頸組織中Survivin的表達(dá)，SP法

圖2 子宮頸癌組織中miR-153、Survivin表達(dá)的相關(guān)性

表2 miR-153、Survivin表達(dá)與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2 miR-153、Survivin表達(dá)與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系子宮頸癌中miR-153、Survivin的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、TNM分期均無關(guān)(P>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(χ2=6.455，χ2=5.937，P均<0.05，表2)；且通過散點圖及相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者其受侵?jǐn)?shù)目與miR-153表達(dá)量之間呈負(fù)相關(guān)，與Survivin表達(dá)量之間呈正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

圖3 A.子宮頸癌中miR-153表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的相關(guān)性；B.子宮頸癌中Survivin表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的相關(guān)性

2.3 miR-153、Survivin表達(dá)與子宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系隨訪50例子宮頸癌患者3年，無失訪，隨訪率為100%。miR-153高表達(dá)患者生存率(73.33%)明顯高于低表達(dá)患者(45.71%)；Survivin高表達(dá)患者生存率(45.95%)明顯低于低表達(dá)患者(76.92%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.390，χ2=27.921，P均<0.001，圖4)。

圖4 A.子宮頸癌中miR-153表達(dá)與患者3年生存率的關(guān)系；B.子宮頸癌中Survivin表達(dá)與患者3年生存率的關(guān)系

3 討論

近年受病毒感染、生物學(xué)因素、分娩次數(shù)及其他眾多因素的影響，子宮頸癌的發(fā)病趨勢呈逐年上升趨勢，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究表明，眾多基因、蛋白均會參與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展[7-10]，且miRNA的異常表達(dá)與婦科腫瘤的抑癌或促癌關(guān)系密切[11]。內(nèi)源性短鏈RNA能夠通過與靶基因部分或完全互補(bǔ)抑制其翻譯或令其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平沉默基因表達(dá)的作用。miRNA家族作為基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，參與多條信號通路的調(diào)控，而對其靶基因的確定及功能分析是理解miRNA作用機(jī)制的關(guān)鍵。因此，本實驗通過檢測miR-153和Survivin在子宮頸癌組織和正常子宮頸組織中的表達(dá)水平，探討其在子宮頸癌中的作用機(jī)制，預(yù)測其在臨床中的作用。

miR-153是新近發(fā)現(xiàn)與腫瘤密切相關(guān)的miRNA之一，在不同的腫瘤組織中其表達(dá)不盡相同。miR-153在導(dǎo)管腺癌、乳腺癌、骨肉瘤中表達(dá)明顯下調(diào)，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲；而在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，會間接增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，促進(jìn)疾病發(fā)展[12-14]，目前還未見miR-153在子宮頸癌中的相關(guān)分析。本實驗發(fā)現(xiàn)，miR-153在子宮頸癌組織中的相對表達(dá)量明顯低于正常子宮頸組織(t=16.333，P<0.01)；進(jìn)一步分析miR-153與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，miR-153表達(dá)與子宮頸癌患者年齡、腫瘤大小、TNM分期無關(guān)(P>0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(χ2=6.455，P<0.05)；通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者其受侵?jǐn)?shù)目與miR-153表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)；通過miR-153表達(dá)水平與患者的生存情況分析，miR-153高表達(dá)患者生存率、中位生存期(73.33%、24個月)明顯高于低表達(dá)患者(45.71%、17個月)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.390，P=0.01)。以上結(jié)果說明miR-153表達(dá)水平下調(diào)可能促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞增殖，并對子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用。

Survivin是目前篩選分離的分子量最小，但凋亡抑制活性最強(qiáng)的抑制因子，通過對半胱氨酸蛋白酶Caspase-3和Caspase-7活性的抑制發(fā)揮抗凋亡作用，通過對細(xì)胞周期的調(diào)控促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。有關(guān)文獻(xiàn)報道Survivin在胃癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤中均高表達(dá)[15-16]。本實驗發(fā)現(xiàn)，Survivin在子宮頸癌組織中的相對表達(dá)量明顯高于正常子宮頸組織(t=6.407，P均<0.01)；通過散點圖及相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)在子宮頸癌組織中miR-153和Survivin表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)；進(jìn)一步分析Survivin與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，Survivin表達(dá)與子宮頸癌患者年齡、腫瘤大小、TNM分期無關(guān)(P>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(χ2=5.937，P<0.05)；通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者其受侵?jǐn)?shù)目和Survivin表達(dá)量之間呈正相關(guān)(P<0.01)；通過分析Survivin表達(dá)水平與患者生存曲線發(fā)現(xiàn)，Survivin高表達(dá)患者生存率、中位生存期(45.95%、16個月)明顯低于低表達(dá)患者(76.92%、25個月)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=27.921，P<0.01)。以上結(jié)果說明在子宮頸癌組織中Survivin相對高表達(dá)會抑制子宮頸癌細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞周期，使癌細(xì)胞增殖過度，導(dǎo)致子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，miR-153在子宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與Survivin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，可能調(diào)控Survivin表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但由于本實驗樣本數(shù)較少，關(guān)于miR-153的具體調(diào)控Survivin機(jī)制及信號通路尚需后續(xù)深入探討。