杜洪亮，車銀富，于 濤，陶 峰，何等旗

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是發(fā)生于涎腺常見的惡性腫瘤，占涎腺惡性腫瘤的7.5%～10%[1]，具有沿神經(jīng)侵襲性進(jìn)展，易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的特性，神經(jīng)侵襲是其重要的生物學(xué)特性[2-3]。近年多種細(xì)胞蛋白的表達(dá)被認(rèn)為與腫瘤相關(guān)，包括CXCR1、VEGF、N-cadherin、YAP、vimentin、MYB、Survivin等[4-7]。CXCR1是趨化因子CXCR家族的重要成員，研究顯示其異常表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。N-cadherin介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附，其表達(dá)增加可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。Ki-67是細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物[10]，vimentin穩(wěn)定表達(dá)于間葉細(xì)胞，其異常表達(dá)與細(xì)胞發(fā)生間葉表型轉(zhuǎn)變有關(guān)[11]。目前，CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin在SACC中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵襲的關(guān)系尚不清楚。本文通過檢測CXCR1、N-cadherin、Ki-67和vimentin蛋白在SACC中的表達(dá)，分析其與臨床病理特征、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)侵襲的關(guān)系，為SACC相關(guān)機(jī)制分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集蘭州大學(xué)第一醫(yī)院口腔頜面外科2013年1月～2018年12月病理確診的SACC蠟塊標(biāo)本39例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)發(fā)生于大涎腺或小涎腺；(2)臨床病理資料完整；(3)術(shù)前均未接受放、化療，并均在我院接受手術(shù)治療；(4)蠟塊標(biāo)本合格。SACC中男性19例，女性20例，年齡21～87歲，平均50歲。腫瘤位于大涎腺26例(腮腺14例、舌下腺9例、頜下腺3例)，位于小涎腺13例(上腭10例，頰腺2例，顳下窩1例)。另選取10例癌旁正常涎腺組織作為對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)獲蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法免疫組化采用SP法染色，試劑購自北京中杉金橋公司。兔抗人CXCR1、N-cadherin多克隆抗體，購自Santa Cruz公司；鼠抗人Ki-67單克隆抗體，購自北京中杉金橋公司；鼠抗人vimentin單克隆抗體(檢測包含腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì))，購自Bio Genex公司；具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判斷免疫組化染色評(píng)估由兩名病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行。首先進(jìn)行定性分析抗體染色表達(dá)模式的差異，然后進(jìn)行定量分析。兩名病理醫(yī)師判斷的差異通過討論解決，有爭議標(biāo)本請(qǐng)第三名病理科醫(yī)師閱片。CXCR1陽性為胞質(zhì)或胞核中呈棕黃色顆粒。N-cadherin陽性為細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色。Ki-67陽性為細(xì)胞核內(nèi)呈棕黃色顆粒。vimentin陽性主要定位于胞質(zhì)，靠近胞膜，呈棕黃色顆粒。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)100倍視野，按細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計(jì)分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分， 51%～75%為3分，>75%為4分；兩項(xiàng)得分結(jié)果相加< 2分為(-)，2～3分為(+)，4～5分為()，6～7分為()，本實(shí)驗(yàn)將0～3分定義為陰性，4～7定義為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。CXCR1、E-cadherin、Ki-67、vimentin在SACC與癌旁正常組織之間表達(dá)的差異采用χ2檢驗(yàn)，CXCR1、E-cadherin、Ki-67、vimentin的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵襲的關(guān)系采用Fisher確切概率法分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin在SACC和癌旁正常組織中的表達(dá)CXCR1在癌旁正常組織中極少表達(dá)，在SACC組織細(xì)胞中大量表達(dá)，且陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核中較少表達(dá)。N-cadherin陽性染色主要定位于細(xì)胞膜。Ki-67陽性染色主要定位于細(xì)胞核。vimentin陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)。SACC中CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin的陽性率分別為66.67%、74.36%、56.41%、71.79%，與癌旁正常組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05，表1，圖1～4)。

圖1 A.CXCR1在癌旁正常組織中的表達(dá)，SP法；B.CXCR1在SACC組織中的表達(dá)，SP法 圖2 A.N-cadherin在癌旁正常組織中的表達(dá)，SP法；B.N-cadherin在SACC組織中的表達(dá)，SP法 圖3 A.Ki-67在癌旁正常組織中的表達(dá)，SP法；B.Ki-67在SACC組織中的表達(dá)，SP法

圖4 A.vimentin在癌旁正常組織中的表達(dá)，SP法；B.vimentin在SACC組織中的表達(dá)，SP法

表1 SACC和癌旁正常組織中CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin的表達(dá)[n(%)]

組間比較，*P<0.05

2.2 CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin的表達(dá)與SACC臨床病理特征的關(guān)系CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin表達(dá)與患者年齡、性別、發(fā)生部位、浸潤深度，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CXCR1、N-cadherin、Ki-67表達(dá)與腫瘤大小，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，vimentin表達(dá)與腫瘤直徑≥3 cm和<3 cm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)。Ki-67在低分化組與中+高分化組的表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CXCR1、N-cadherin和vimentin在低分化組和中+高分化組的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017，P=0.002，P=0.011，表2)。

2.3 CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵襲的關(guān)系CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CXCR1和vimentin表達(dá)與有無神經(jīng)侵襲，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。N-cadherin和Ki-67表達(dá)與有無神經(jīng)侵襲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017，表3)。

3 討論

SACC是具有神經(jīng)侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特性的涎腺惡性腫瘤[12]。多種趨化因子和蛋白的表達(dá)與SACC的神經(jīng)侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[13-15]。CXCR1是CXC趨化因子受體家族的重要成員，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、淋巴單核細(xì)胞等各種炎癥細(xì)胞表面，大量研究發(fā)現(xiàn)，CXCR1與多種腫瘤的發(fā)生、增殖、生長、侵襲轉(zhuǎn)移等發(fā)揮重要作用[16-17]。亦有研究顯示，CXCL12/CXCR4可能與SACC嗜神經(jīng)侵襲有關(guān)[18]。本組CXCR1在SACC組織細(xì)胞中大量表達(dá)，且陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，且CXCR1在SACC的表達(dá)比癌旁正常涎腺組織明顯增高；提示CXCR1的表達(dá)與SACC相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CXCR1在低分化組的表達(dá)明顯高于中+高分化組，與Xue等[19]的研究一致，但未發(fā)現(xiàn)CXCR1的表達(dá)與患者年齡、性別、發(fā)生部位、浸潤深度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵襲，差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 SACC中CXCR1、E-cadherin、Ki-67、vimentin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

a為Fisher精確概率檢驗(yàn)

表3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵襲與CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin表達(dá)的關(guān)系

a為Fisher精確概率檢驗(yàn)

鈣黏蛋白轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)的重要機(jī)制之一，表現(xiàn)為E-cadherin向N-cadherin轉(zhuǎn)化[20]。研究顯示，N-cadherin表達(dá)的增高與多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)[21]。本組N-cadherin的表達(dá)在SACC組織中明顯升高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)N-cadherin在低分化組的表達(dá)高于中+高分化組，且存在神經(jīng)侵襲SACC中N-cadherin的表達(dá)明顯增高，與Yi等[22]的研究一致， N-cadherin在膽囊癌低分化組的表達(dá)高于中+高分化組，且存在侵襲組N-cadherin的表達(dá)明顯增高；提示N-cadherin高表達(dá)與SACC的神經(jīng)侵襲和分化程度有關(guān)。

Ki-67是細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白，其與腫瘤增殖、侵襲、預(yù)后密切相關(guān)[10]。本組Ki-67在SACC中的表達(dá)高于癌旁正常組織，且在有神經(jīng)侵襲的SACC中的表達(dá)明顯增高；提示Ki-67與SACC的神經(jīng)侵襲可能有關(guān)。Ki-67表達(dá)增多說明細(xì)胞增殖活躍，提示腫瘤細(xì)胞增殖與神經(jīng)侵襲可能相關(guān)。目前，Ki-67表達(dá)與神經(jīng)侵襲之間的關(guān)系，國內(nèi)外研究尚未見報(bào)道。

研究顯示，EMT是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素。vimentin作為EMT過程中的重要因子，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等復(fù)雜過程[23]。本組vimentin在SACC中的表達(dá)明顯增高，且其高表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤分化程度相關(guān)。有研究表明，vimentin可以控制細(xì)胞增殖，如一些促進(jìn)細(xì)胞增殖的因素：血小板衍生生長因子、胰島素和表皮生長因子可以增加小鼠3T3細(xì)胞中vimentin mRNA的水平[24]。vimentin的丟失可以減少成纖維細(xì)胞的增殖，降低EMT的主要起始物TGF-β1的水平[25]。

綜上所述，CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin的表達(dá)與SACC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。N-cadherin和Ki-67與SACC的神經(jīng)侵襲相關(guān)。CXCR1、N-cadherin和vimentin與SACC的細(xì)胞分化程度相關(guān)。目前，其具體機(jī)制尚不清楚，需更深入的分析CXCR1、N-cadherin、Ki-67和vimentin與SACC臨床病理特征的關(guān)系。