張明珍，胡知齊，羅 兵，劉必勇，開(kāi)金云

乳腺癌是我國(guó)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)與乳腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)[1]。干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon, STING)是cGAS-STING信號(hào)通路的核心調(diào)節(jié)分子，作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的DNA感受器，參與固有免疫應(yīng)答，與惡性腫瘤及調(diào)節(jié)其TME中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)。目前，有關(guān)STING蛋白表達(dá)與乳腺癌的報(bào)道較少[2]。因此，本文采用免疫組化SP法檢測(cè)乳腺癌組織及其癌旁正常組織中STING蛋白的表達(dá)，分析其與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系，為臨床診斷與治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料回顧性分析安徽省第二人民醫(yī)院普外科2016年7月～2018年6月入院乳腺癌患者的臨床資料，依據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)選取入組病例。納入標(biāo)準(zhǔn)：本組分析對(duì)象均行外科手術(shù)，經(jīng)病理學(xué)檢查確診為乳腺癌；能夠留取完整的病理學(xué)資料，提供足夠行免疫組化檢查的癌組織和癌旁正常組織(距離癌組織2 cm)樣本。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤者；術(shù)前行新輔助治療者。經(jīng)篩選共入組42例，患者均為女性，平均年齡(38 ±11)歲；TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期32例，Ⅲ期7例；分子分型：Lumina A型13例，Lumina B型17例，H型5例，TNBC型7例。

1.2 方法免疫組化采用SP法染色，常規(guī)行組織脫水、透明、浸蠟、包埋、切片和烤片、切片脫蠟、抗原修復(fù)，用3%的過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，并滴加正常山羊血清室溫封閉30 min。用油性筆在組織周?chē)?huà)圈標(biāo)記，并滴加稀釋好的一抗(STING、CST稀釋比1 ∶1 000)，于4 ℃濕盒中孵育15 h。PBS沖洗3次，每次3 min，吸水紙擦干切片后滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育20 min。PBS沖洗切片4次，每次3 min，吸水紙擦干切片后滴加新鮮配制的DAB顯色液；再進(jìn)行復(fù)染、脫水、封固。

1.3 結(jié)果判斷STING蛋白陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。免疫組化結(jié)果判斷需根據(jù)細(xì)胞著色深度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比綜合評(píng)價(jià)。(1)按陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察，記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比率并取其平均值：≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。其中將兩者得分結(jié)果相乘為最終得分，≥1分為陽(yáng)性，<1分為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比表示；多組總體比較用R×C列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)，兩組之間比較用Fisher精確檢驗(yàn)；采用二元Logistic回歸模型分析各參數(shù)與乳腺癌術(shù)后是否復(fù)發(fā)之間的關(guān)聯(lián)性；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌及癌旁正常組織中STING蛋白的表達(dá)STING蛋白陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)，本組42例乳腺癌患者，其乳腺癌組織中STING蛋白陽(yáng)性10例(10/42，23.8%)，癌旁正常組織22例(22/42，52.4%)，STING在乳腺癌組織中的陽(yáng)性率低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.269，P<0.05，圖1、2)。

圖1 癌旁正常組織中STING蛋白呈陽(yáng)性，SP法 圖2 乳腺癌組織中STING蛋白呈陰性，SP法

2.2 STING蛋白表達(dá)與乳腺癌病理特征的關(guān)系STING蛋白表達(dá)與乳腺癌Lumina分型有關(guān)(P<0.05)；STING蛋白表達(dá)與TNM分期、組織學(xué)分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05，表1)。

表1 STING蛋白表達(dá)與乳腺癌病理特征的關(guān)系

2.3 多因素Logistic回歸模型分析對(duì)42例乳腺癌患者術(shù)后進(jìn)行隨訪1～5年，23例乳腺癌患者發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)，19例乳腺癌患者未發(fā)生復(fù)發(fā)。本實(shí)驗(yàn)選取患者年齡、分子分型、TNM分期、STING蛋白表達(dá)水平等為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸模型分析，結(jié)果顯示：STING蛋白低表達(dá)是乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，表2)。

表2 乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素Logistic回歸模型分析

3 討論

國(guó)內(nèi)乳腺癌發(fā)病率高居女性腫瘤發(fā)病率的首位，近年乳腺癌的發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢(shì)。依據(jù)國(guó)內(nèi)外臨床診療指南，對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行TNM分期和Luminal分型，有助于其整體治療方案的選擇和預(yù)后的判斷[3-4]。但是在實(shí)際臨床工作中卻存在一定的局限性，隨著研究的深入，一系列與分子靶向治療及免疫治療相關(guān)的蛋白分子不斷被發(fā)現(xiàn)[5-7]，如何更加準(zhǔn)確地對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行分類(lèi)逐漸成為新的挑戰(zhàn)。

環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-腺苷合成酶 —— cGAS-STING作為經(jīng)典的固有免疫應(yīng)答信號(hào)通路，在先天性免疫中發(fā)揮重要作用，且被證實(shí)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。其核心調(diào)節(jié)分子STING存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在人體細(xì)胞受外源性核酸污染或自身DNA損傷出現(xiàn)核泄漏時(shí)，發(fā)揮“哨兵”的作用，識(shí)別并激活下游通路產(chǎn)生INF-β，從而募集并激活免疫細(xì)胞，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤組織內(nèi)STING蛋白處于低表達(dá)狀態(tài)，可能與其參與免疫抑制及免疫逃逸相關(guān)[8]。本組乳腺癌組織中的STING蛋白陽(yáng)性率低于癌旁正常組織，與其他相關(guān)研究結(jié)果一致，下調(diào)的STING-TBK-l-IRF-3通路可能參與癌癥進(jìn)程[9]。TME是腫瘤細(xì)胞周?chē)闹С纸M織，一般由細(xì)胞外基質(zhì)、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等組成，其構(gòu)成復(fù)雜，功能多樣，且在不同患者體內(nèi)表現(xiàn)出較大的差異性，檢測(cè)及評(píng)估TME有助于指導(dǎo)患者進(jìn)行惡性腫瘤的精準(zhǔn)治療[10]。目前，已有相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示激活STING通路，可以達(dá)到上調(diào)腫瘤周?chē)h(huán)境免疫細(xì)胞的功能。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STING蛋白低表達(dá)是乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，STING蛋白有望成為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)STING蛋白表達(dá)與患者的分子分型相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HER-2可以激活經(jīng)典的乳腺癌HER-2-AKT1信號(hào)通路，并能夠強(qiáng)烈抑制cGAS-STING信號(hào)通路，產(chǎn)生相關(guān)的免疫抑制效應(yīng)[11]，與本組發(fā)現(xiàn)的STING蛋白陽(yáng)性率在Luminal A、Luminal B型及TNBC中低表達(dá)一致。針對(duì)這些特殊類(lèi)型的乳腺癌患者，可能需要采用不同的靶向治療策略。

綜上所述，乳腺癌組織中STING蛋白表達(dá)降低，與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)，可能參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，有助于評(píng)價(jià)腫瘤分子分型，對(duì)指導(dǎo)乳腺癌治療和預(yù)后判斷具有一定的參考價(jià)值。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，將從分子水平進(jìn)一步研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制，實(shí)現(xiàn)患者的個(gè)體化精準(zhǔn)治療，為患者帶來(lái)新的機(jī)遇。