劉佳瑞，孫 斌，崔曉賓，徐 江

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是頭頸部惡性腫瘤中最常見的腫瘤之一[1]。近年來(lái)對(duì)OSCC早期診斷生物標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)等方面研究雖然有新的進(jìn)展[2]，但目前OSCC患者總體存活率仍然較低[3]。因此，為提高OSCC患者的存活率，尋找OSCC的新型生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。磷脂酶Cε1(phospholipase C epsilon-1, PLCE1)由染色體10q23上的PLCE1基因編碼，屬于磷酸肌醇特異性磷脂酶C(PLC)家族[4]。最近的研究報(bào)道顯示，PLCE1可能在多數(shù)腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，包括食管癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)直腸癌等[5-8]。但是，有關(guān)PLCE1在OSCC中表達(dá)的研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化EnVision法檢測(cè)PLCE1在OSCC和癌旁正常組織中的表達(dá)，并探討PLCE1表達(dá)與OSCC臨床病理特征和術(shù)后生存率的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2004～2018年石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科存檔的石蠟包埋OSCC標(biāo)本合計(jì)124例，同時(shí)選取對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織(距離癌組織2 cm以上)63例作為對(duì)照組，并收集患者完整的臨床病理資料。其中男性71例，女性53例，平均年齡67歲(34～84歲)，患者術(shù)前均未接受過放療或化療。所有病例的TNM分期是以口腔癌TNM分期(UICC 2010)為依據(jù)劃分。通過電話、醫(yī)院病歷或其他方法對(duì)124例患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止日期為2019年5月31日。參與本實(shí)驗(yàn)的所有患者均簽署書面知情同意書。

1.2 組織芯片的制備核對(duì)所選取的OSCC蠟塊組織的HE切片病理診斷，并在玻片上對(duì)該區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記，對(duì)照HE切片上相應(yīng)的區(qū)域在蠟塊上準(zhǔn)確的標(biāo)記組織芯片取材位點(diǎn)，使用Mitogen公司MiniCore組織芯片制作儀構(gòu)建組織芯片，4 μm厚連續(xù)切片備用。

1.3 方法免疫組化染色采用EnVision兩步法。PLCE1兔多抗購(gòu)自美國(guó)Affinity公司，稀釋度1 ∶1 200。所有染色結(jié)果均由兩位高年資的病理醫(yī)師獨(dú)立雙盲法閱片，PLCE1定位于細(xì)胞質(zhì)中，以呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性。(1)按細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分。(2)按陽(yáng)性細(xì)胞的百分比計(jì)分：<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分，將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：9～12分為()，5～8分為()，2～4分為(+)，0～1分為(-)。其中≤8分為低表達(dá)，>8分為高表達(dá)。若對(duì)結(jié)果存在分歧則請(qǐng)第三位醫(yī)師閱片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用χ2檢驗(yàn)評(píng)估PLCE1表達(dá)與其他變量間的相關(guān)性。ROC曲線和曲線下面積(AUC)用于評(píng)估PLCE1表達(dá)對(duì)于預(yù)測(cè)OSCC的特異度和靈敏度。使用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，并使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)分析存活曲線。使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型計(jì)算該不同變量的單變量和多變量風(fēng)險(xiǎn)比。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSCC中PLCE1蛋白的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系PLCE1在OSCC組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，OSCC中PLCE1的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。PLCE1在OSCC組織中多呈高表達(dá)，在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)(圖1)。PLCE1在OSCC及正常組織中的高表達(dá)率分別為41.9%(52/124)和0(0/63)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1，表1)。PLCE1表達(dá)與OSCC患者年齡、性別、腫瘤分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期無(wú)關(guān)(P>0.05，表2)。

圖1 A.PLCE1在OSCC中高表達(dá)，EnVision兩步法；B.PLCE1在癌旁正常組織中低表達(dá)，EnVision兩步法

表1 OSCC及癌旁正常組織中PLCE1的表達(dá)

表2 OSCC中PLCE1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 PLCE1表達(dá)與OSCC的ROC曲線分析本實(shí)驗(yàn)使用ROC曲線分析PLCE1在OSCC及對(duì)照組織中免疫組化評(píng)分的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示PLCE1表達(dá)在OSCC的ROC曲線下AUC值為0.954(95%CI：0.925～0.982)(圖2)，使用診斷臨界值確定OSCC的靈敏度和特異性，同時(shí)最小化假陰性率和假陽(yáng)性率，得出OSCC的靈敏度和特異性分別為83.9%和95.2%(診斷臨界點(diǎn)為7)。

圖2 ROC曲線分析PLCE1在OSCC及對(duì)照組織中免疫組化評(píng)分

2.3 PLCE1蛋白表達(dá)與OSCC患者預(yù)后的關(guān)系124例OSCC中，74例患者獲得臨床隨訪信息。隨訪截止日期為2019年5月31日或死亡日期。對(duì)74例OSCC患者的單因素分析顯示，PLCE1蛋白高表達(dá)患者比低表達(dá)患者預(yù)后較差。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，PLCE1蛋白高表達(dá)患者的生存時(shí)間與PLCE1蛋白低表達(dá)患者相比差異有顯著性(χ2=8.416，P=0.004，圖3A)，PLCE1高表達(dá)患者的術(shù)后病死率高于低表達(dá)患者。此外，T分期對(duì)OSCC患者的預(yù)后也具有顯著的意義(χ2=9.647，P=0.002，圖3B)。

圖3 PLCE1蛋白表達(dá)與OSCC患者預(yù)后生存分析：A.PLCE1表達(dá)；B.T分期

2.4 OSCC患者的Cox單因素及多因素分析對(duì)PLCE1蛋白表達(dá)和所有臨床病理學(xué)因素進(jìn)行單因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，PLCE1過表達(dá)(P=0.006；風(fēng)險(xiǎn)比為3.117，表3)和T分期(P=0.004；HR為3.330)是單因素Cox回歸模型中的重要因素；多因素分析顯示，PLCE1過表達(dá)(P=0.008；HR為3.027)和T分期(P=0.005；HR為0.312)與死亡有關(guān)，是OSCC患者獨(dú)立的預(yù)后因素。

表3 Cox單因素及多因素分析影響OSCC患者生存的臨床病理因素

3 討論

PLCE1與PLC家族的其他分子相比具有不同的功能，其是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和血管生成的Ras家族蛋白的重要效應(yīng)物[9]。最近的研究表明PLCE1的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。Yue等[10]的研究表明，PLCE1在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，可通過促進(jìn)PTEN甲基化抑制非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞凋亡；而在Wang等[11]的研究中發(fā)現(xiàn)，PLCE1可作為結(jié)腸癌的抑癌基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。然而，關(guān)于PLCE1的表達(dá)及其在OSCC中的研究很少。

在本組實(shí)驗(yàn)中，作者發(fā)現(xiàn)OSCC組織中PLCE1蛋白表達(dá)較癌旁正常組織明顯增高，提示PLCE1蛋白可能是潛在的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)PLCE1表達(dá)與OSCC患者臨床病理資料相關(guān)研究極少。僅有李曉岑等[12]對(duì)83例OSCC患者進(jìn)行免疫組化分析的報(bào)道，結(jié)果顯示PLCE1蛋白在OSCC中的高表達(dá)率為53.0%，且PLCE1蛋白與腫瘤分化程度、T分期、臨床分期、N分期密切相關(guān)。這與本組結(jié)果存在差異，究其原因可能與樣本量的選擇區(qū)域等因素有關(guān)，后期我們需要加大樣本量來(lái)進(jìn)一步分析。AUC被認(rèn)為是評(píng)估一個(gè)試驗(yàn)診斷價(jià)值最好的指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)通過ROC曲線分析，表明PLCE1有較高診斷效能，提示PLCE1對(duì)OSCC的診斷具有較高的靈敏度(83.9%)和特異性(95.2%)。并應(yīng)用ROC曲線確定了診斷OSCC的臨界值，為今后診斷OSCC提供一種新的生物學(xué)檢測(cè)方法?？傊@些結(jié)果支持PLCE1可能是OSCC潛在的一種新型臨床診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

研究表明PLCE1在其他惡性腫瘤中具有預(yù)后意義。Cheng等[13]報(bào)道，PLCE1低表達(dá)與肝細(xì)胞癌的進(jìn)展相關(guān)，并且可能作為其預(yù)后的生物標(biāo)志物；此外，張曉娟等[14]報(bào)道了PLCE1在食管鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤最大徑密切相關(guān)，提示PLCE1可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的不良預(yù)后相關(guān)。PLCE1似乎通過調(diào)節(jié)PKCα激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的侵襲和遷移，這可能成為治療食管癌的新靶點(diǎn)[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，作者對(duì)納入的患者進(jìn)行跟蹤隨訪，應(yīng)用Kaplan-Meier法對(duì)兩組患者的生存率進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLCE1高表達(dá)組患者的術(shù)后生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組，證實(shí)了PLCE1與OSCC患者的生存率密切相關(guān)，可應(yīng)用PLCE1來(lái)判斷OSCC患者預(yù)后。在本實(shí)驗(yàn)中也對(duì)OSCC患者不同的臨床病理特征進(jìn)行了生存分析，結(jié)果表明T分期對(duì)患者的預(yù)后有重要的意義，而年齡、性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期各組間無(wú)明顯差異。單因素Cox回歸模型分析結(jié)果與上述結(jié)果一致。此外，多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型結(jié)果顯示，PLCE1高表達(dá)和T分期具有較高的風(fēng)險(xiǎn)比，分別為3.027和3.205，說明兩者均是影響OSCC患者能否長(zhǎng)期存活的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)?？傊?，以上結(jié)果表明PLCE1表達(dá)與OSCC患者的術(shù)后生存時(shí)間密切相關(guān)，具有重要的預(yù)后意義，PLCE1表達(dá)越高，患者預(yù)后越差。

綜上所述，本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PLCE1在OSCC中高表達(dá)，PLCE1高表達(dá)是OSCC預(yù)后不良的重要獨(dú)立預(yù)后因素，因此可用作OSCC患者診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。但是我們還需要大量的臨床樣本結(jié)合臨床資料隨訪來(lái)明確PLCE1表達(dá)與OSCC各種臨床病理特征的相關(guān)性，PLCE1及其下游相關(guān)信號(hào)分子在OSCC中的表達(dá)情況的研究也將成為下一階段的研究方向。