王婷婷，李忠華，李慧峰，楊文秀，李曉蕾

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，5年相對(duì)存活率為18%[1]，約85%的肺癌是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[2]。多數(shù)患者在確診時(shí)被發(fā)現(xiàn)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后差[3]，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素是血管生成。YAP1是HIPPO通路的核心效應(yīng)因子，高表達(dá)的YAP1參與腫瘤的增殖、復(fù)發(fā)、遷移等惡性行為，最近研究顯示其還參與腫瘤的血管生成過(guò)程[4]。SRPX2參與腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程，并對(duì)血管生成具有積極的促進(jìn)作用[5]。Marti等[6]研究顯示SRPX2是YAP1依賴的基因，YAP1可能通過(guò)SRPX2發(fā)揮作用，但兩者在NSCLC中表達(dá)的相關(guān)性未見(jiàn)報(bào)道。本文著重探討YAP1和SRPX2在NSCLC組織中表達(dá)的相關(guān)性及兩者表達(dá)與微血管密度(microvessel density, MVD)的關(guān)系，為NSCLC的病理診斷和臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料選取貴州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院2010～2019年存檔的穿刺活檢或手術(shù)切除診斷為NSCLC的石蠟標(biāo)本80例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病例經(jīng)病理診斷為NSCLC；(2)初次治療，臨床和病理資料保存完整；(3)無(wú)其他類型的腫瘤；(4)術(shù)前未接受過(guò)放、化療。本組患者男性47例，女性33例。年齡37～83歲，其中<60歲者40例，≥60歲者40例。病理分型：鱗癌36例，腺癌44例。TNM分期：Ⅰ期28例，Ⅱ+Ⅳ期52例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例；選取28例癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)作為對(duì)照。所有標(biāo)本的使用均經(jīng)患者知情同意，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑兔抗人YAP1、SRPX2、CD34多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒、Western blot試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司。ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒，均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3 Western blot法提取肺鱗癌、肺腺癌及其癌旁正常組織中的蛋白，測(cè)定組織蛋白濃度，沸水浴使蛋白變性。配置分離膠和濃縮膠后置于電泳槽固定，加入電泳液后上樣待測(cè)蛋白開(kāi)始電泳。濕化轉(zhuǎn)膜，切取適當(dāng)大小的PVDF膜，在裝有轉(zhuǎn)膜液的方盤內(nèi)依次放置轉(zhuǎn)膜夾、海綿夾、濾紙、膠、PVDF膜，趕走氣泡后合攏轉(zhuǎn)膜夾，置于轉(zhuǎn)膜槽中冰浴轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出膜，根據(jù)蛋白分子量剪膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉液稀釋一抗YAP1和SRPX2，4 ℃過(guò)夜。TBST洗滌3次后，加入二抗，孵育2 h。ECL避光顯色，自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集結(jié)果。

1.4 免疫組化NSCLC組織及其癌旁正常組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，厚4 μm。65 ℃烤2.5 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，待微波爐內(nèi)pH 6.5的枸櫞酸鈉緩沖液沸騰后，放入切片轉(zhuǎn)入低溫進(jìn)行抗原修復(fù)10 min，室溫下復(fù)溫。滴入3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，山羊血清封閉非特異性位點(diǎn)，分別加入YAP1、SRPX2和CD34(購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，稀釋比為1 ∶100)，4 ℃過(guò)夜。PBS溶液代替一抗作為陰性對(duì)照。室溫復(fù)溫、洗滌后加入二抗、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，DAB溶液顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封固。

1.5 結(jié)果判定光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野觀察切片，YAP1陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒；SRPX2陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計(jì)分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。上述兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～2分為陰性，3～12分為陽(yáng)性。切片均由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立閱片。

1.6 MVD計(jì)數(shù)采用Weidner法，用CD34標(biāo)記腫瘤微血管，于低倍鏡下在腫瘤間質(zhì)內(nèi)尋找微血管密集的區(qū)域，然后用高倍鏡計(jì)數(shù)5個(gè)視野的微血管數(shù)，取其平均值為MVD值。任何可被染成棕黃色呈陽(yáng)性的血管內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，與鄰近血管、腫瘤細(xì)胞或其他組織之間存在明顯分隔的視為1個(gè)微血管。

1.7 隨訪對(duì)確診患者采用復(fù)診或電話方式進(jìn)行隨訪，截止日期為2019年3月，隨訪3～107個(gè)月。

2 結(jié)果

2.1 Western blot法檢測(cè)YAP1和SRPX2在NSCLC及癌旁正常組織中的表達(dá)Western blot法檢測(cè)20例NSCLC組織(肺鱗癌10例、肺腺癌10例)與癌旁正常組織中YAP1和SRPX2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：YAP1和SRPX2在肺鱗癌和肺腺癌組織中的表達(dá)均明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 Western blot法檢測(cè)YAP1、SRPX2蛋白在NSCLC及癌旁正常組織中的表達(dá)：A.YAP1和SRPX2蛋白的表達(dá)：1.癌旁組織，2.肺鱗癌組織，3.肺腺癌組織； B.YAP1蛋白相對(duì)表達(dá)量；C.SRPX2蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.2 免疫組化法檢測(cè)YAP1和SRPX2在NSCLC及癌旁正常組織中的表達(dá)YAP1陽(yáng)性染色主要表達(dá)于細(xì)胞核，少數(shù)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。SRPX2陽(yáng)性染色表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。YAP1和SRPX2在NSCLC組織中的陽(yáng)性率分別為62.5%(50/80)和55%(44/80)；YAP1和SRPX2在癌旁正常組織中的陽(yáng)性率分別為7.14%(2/28)和0。YAP1和SRPX2在NSCLC組織中的陽(yáng)性率均高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2、3)。

圖2 A.YAP1在癌旁正常組織中呈陰性，SP法；B.YAP1在肺鱗癌組織中呈陽(yáng)性，SP法；C.YAP1在肺腺癌組織中呈陽(yáng)性，SP法

圖3 A.SRPX2在癌旁組織中呈陰性，SP法；B.SRPX2在肺鱗癌組織中呈陽(yáng)性，SP法；C.SRPX2在肺腺癌組織中呈陽(yáng)性，SP法

2.3 YAP1、SRPX2及MVD與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系YAP1和SRPX2的表達(dá)與NSCLC患者性別、年齡、吸煙、病理類型、分化程度均無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MVD表達(dá)與NSCLC患者年齡、吸煙、病理類型無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 YAP1、SRPX2表達(dá)及MVD與 NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

圖4 YAP1和SRPX2在NSCLC組織中共表達(dá):YAP1(A)和SR-PX2(B)在同一例肺腺癌組織中呈陽(yáng)性,SP法;YAP1(C)和SRPX2(D)在同一例肺鱗癌組織中呈陽(yáng)性,SP法 圖5 CD34在NSCLC組織中的表達(dá):A.CD34在NSCLC組織中呈陰性,SP法;B.CD34在NSCLC中呈陽(yáng)性,SP法

2.4 YAP1、SRPX2和MVD在NSCLC中表達(dá)的相關(guān)性在80例NSCLC組織中YAP1陽(yáng)性50例，SRPX2陽(yáng)性44例，YAP1陰性30例，SRPX2陰性36例。兩者均陽(yáng)性38例，均陰性24例。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，YAP1與SRPX2在NSCLC組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.545，P<0.05，表2，圖4)。

表2 NSCLC中YAP1與SRPX2表達(dá)的相關(guān)性

YAP1表達(dá)與MVD值均存在正相關(guān)(r=0.580)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SRPX2表達(dá)與MVD值呈正相關(guān)(r=0.475，P<0.05)。YAP1和SRPX2陽(yáng)性組MVD值分別高于YAP1和SRPX2陰性組，且YAP1和SRPX2共同陽(yáng)性組MVD值高于YAP1和SRPX2共同陰性組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3，圖5)。

2.5 YAP1、SRPX2表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，YAP1陰性組生存期明顯高于陽(yáng)性組，Log-rank檢驗(yàn)顯示，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.371，P=0.037)。SRPX2陰性組生存期明顯高于陽(yáng)性組，Log-rank檢驗(yàn)顯示，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.589，P=0.018)。YAP1和SRPX2共陰性組生存期最高，兩者共陽(yáng)性組生存期最短，Log-rank檢驗(yàn)顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.433，P=0.040，圖6)。

表3 NSCLC中YAP1和SRPX2表達(dá)與MVD值的關(guān)系

3 討論

HIPPO信號(hào)通路是由一系列不同的蛋白質(zhì)組成，具有控制器官大小、組織再生等功能[7]，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。YAP1是銜接HIPPO通路和其下游分子的核心因子，在多種惡性腫瘤組織中均為高表達(dá)，具有促癌功能[8-9]。本組通過(guò)Western blot法和免疫組化法檢測(cè)亦顯示，YAP1在NSCLC組織中高表達(dá)，陽(yáng)性率為62.5%，YAP1表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后明顯相關(guān)，與Hsu等[10]的研究結(jié)果一致，提示YAP1可能在NSCLC增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖6 Kaplan-Meier生存曲線分析：A.YAP1表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系；B.SRPX2表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系；C.YAP1和SRPX2不同表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

YAP激活MAPK或PI3K-AKT信號(hào)通路影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[11-12]。SRPX2是屬于新型的硫酸軟骨素蛋白聚糖，在腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)SRPX2可能是MAPK和PI3K-AKT信號(hào)的下游基因[13-14]。SRPX2蛋白與SELP、SELP和SVEP-1同屬于選擇素基因家族，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和促進(jìn)血管生成[15]。本組Western blot法和免疫組化法檢測(cè)均顯示，SRPX2在NSCLC組織中高表達(dá)。SRPX2陽(yáng)性率為55%，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后明顯相關(guān)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，NSCLC組織中YAP1與SRPX2表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.545,P<0.05)。YAP1和SRPX2共陰性組生存期明顯高于兩者共陽(yáng)性組(P=0.043)。以上結(jié)果提示YAP1和SRPX2共同表達(dá)與NSCLC的侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后關(guān)系密切。

MVD是標(biāo)記腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)腫瘤微血管進(jìn)行觀察和量化的常用指標(biāo)。本組采用免疫組化法檢測(cè)CD34在NSCLC組織中的表達(dá)計(jì)數(shù)MVD值，發(fā)現(xiàn)MVD的表達(dá)與NSCLC分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，證實(shí)腫瘤的惡性程度越高，MVD值越高。YAP1可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管生成以及誘導(dǎo)血管發(fā)育不全[16]。SRPX2作為尿激酶纖溶酶原激活物表面受體的配體，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管網(wǎng)絡(luò)的形成。本組實(shí)驗(yàn)分析顯示，YAP1和SRPX2陽(yáng)性組MVD值分別高于YAP1和SRPX2陰性組;Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，YAP1和SRPX2表達(dá)與MVD值均存在正相關(guān)；提示YAP1和SRPX2可能影響NSCLC的血管生成。

綜上所述，本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)YAP1和SRPX2在NSCLC中相互作用，兩者可能共同參與NSCLC的血管生成。因此，深入分析YAP1和SRPX2表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，可能為NSCLC的診斷和靶向治療提供新的線索和思路。