程 凱，章如松，王 璇，魏 雪，夏秋媛，沈 勤，周曉軍，饒 秋

胰島素瘤相關(guān)蛋白1(insulinoma-associated protein 1, INSM1)是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在多種組織的神經(jīng)內(nèi)分泌分化中起重要作用[1-2]。最近有研究表明，INSM1在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中高表達，可以作為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的鑒別診斷標志物[3-6]。目前各研究結(jié)果尚存在一定的差異，且缺乏中國大陸人群的數(shù)據(jù)報道。因此，本文采用手工免疫組化EnVision兩步法檢測肺小細胞癌、大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌、肺類癌等組織中INSM1的表達，并與傳統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌標志物進行對比分析，以期進一步明確INSM1在臨床病理診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010～2018年中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院(原南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)病理科存檔的石蠟包埋標本196例，包括肺小細胞癌26例，大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌23例，肺類癌23例，肺腺癌72例，肺鱗癌52例。所有標本均行HE染色，并且經(jīng)本院兩位高年資病理醫(yī)師確診。

1.2 主要試劑一抗：鼠抗人單克隆抗體INSM1購自Santa Cruz公司(稀釋度1 ∶300)；即用型單抗Syn、CgA、CD56，均購自北京中杉金橋公司。HRP標記的鼠兔通用型二抗及DAB顯色液均購自DAKO公司。

1.3 免疫組化免疫組化染色采用EnVision兩步法，3～4 μm厚石蠟切片經(jīng)脫蠟，水化，行高溫高壓抗原修復(fù)(10%檸檬酸鹽抗原修復(fù)緩沖液，pH 6.0)；每張切片滴加50 μL一抗，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗；滴加50 μL EnVision試劑，室溫下孵育30 min；PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精襯染。

1.4 結(jié)果判讀INSM1陽性定位于細胞核，Syn和CgA陽性定位于細胞質(zhì)，CD56陽性定位于細胞質(zhì)和細胞膜，>1%的腫瘤細胞著色即判讀為陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析采用STATA 12.0軟件進行統(tǒng)計學分析，并采用Graphpad 7.0制圖，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用χ2檢驗分析INSM1在不同類別腫瘤中的表達差異，采用確切概率法分析INSM1與傳統(tǒng)抗體的敏感性和特異性的差異，采用Kappa一致性檢驗分析4 ℃和37 ℃免疫組化檢測INSM1表達的一致性。

2 結(jié)果

2.1 INSM1在肺腫瘤組織中的表達本實驗從整體分析INSM1在肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤與肺腺癌和肺鱗癌中表達的差異。INSM1在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中呈較強的細胞核著色，在個別肺腺癌和肺鱗癌中呈較弱的細胞核著色。72例肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(包括肺小細胞癌、大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肺類癌)中有63例表達INSM1，總陽性率為87.5%，在肺腺癌中的陽性率約為2.8%，在肺鱗癌中的陽性率為1.9%。INSM1在肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的陽性率高于肺腺癌和肺鱗癌(P<0.000 1，表1，圖1)。

表1 肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、肺腺癌與肺鱗癌中INSM1的表達

2.2 INSM1與傳統(tǒng)神經(jīng)內(nèi)分泌標志物敏感性比較本實驗發(fā)現(xiàn)，INSM1在肺小細胞癌中敏感性為88.5%，與Syn以及CD56相同，顯著高于CgA(P=0.026 6，圖2A)；INSM1在肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的敏感性為78.3%，與Syn以及CD56相似，顯著高于CgA(P=0.015 6，圖2B)；INSM1在肺類癌中的敏感性為95.6%，與Syn、CgA、CD56差異無統(tǒng)計學意義(P>0.999，圖2C)。在同一病例中，INSM1和Syn及CD56的表達較一致，未發(fā)現(xiàn)互補作用。此外，INSM1在肺小細胞癌、大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肺類癌中的敏感性，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

表2 INSM1與傳統(tǒng)神經(jīng)內(nèi)分泌標志物敏感性比較[n(%)]

敏感性=真陽性例數(shù)/真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)

2.3 INSM1與Syn、CgA和CD56在肺腺癌和肺鱗癌中的特異性比較本組實驗檢測72例肺腺癌和52例肺鱗癌中INSM1、Syn、CgA和CD56的表達。肺腺癌和肺鱗癌合計124例，其陽性率分別約為2.4%、8.9%、0.8%和11.3%。本實驗結(jié)果顯示：INSM1、Syn、CgA和CD56在肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤診斷中的特異性分別為97.6%、91.1%、99.2%和88.7%。INSM1的特異性顯著高于CD56(P=0.01)，與Syn和CgA差異無顯著性(P=0.051，P=0.622，表3)。

圖1 A.INSM1在肺小細胞癌中的表達，EnVision兩步法；B.INSM1在肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的表達，EnVision兩步法；C.INSM1在典型肺類癌中的表達，EnVision兩步法；D.INSM1在非典型肺類癌中的表達，EnVision兩步法；E.ISNM1在肺腺癌中的表達，EnVision兩步法；F.INSM1在肺鱗癌中的表達，EnVision兩步法

圖2 A.INSM1、Syn、CgA及CD56在肺小細胞癌中的表達；B.INSM1、Syn、CgA及CD56在肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中表達；C.INSM1、Syn、CgA及CD56在肺類癌中的表達

表3 INSM1、Syn、CgA和CD56在肺腺癌和肺鱗癌中的特異性比較

*表示INSM1組與其他各組單獨比較的結(jié)果P值；特異性=真陰性例數(shù)/真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)

2.4 INSM1的實驗條件在4 ℃孵育一抗過夜，INSM1在肺小細胞癌、肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肺類癌中的陽性率分別為88.5%、78.3%和95.6%。另采用37 ℃ 1 h孵育一抗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)INSM1在肺小細胞癌、肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肺類癌中的陽性率為84.6%、52.2%和30%。在4 ℃孵育過夜條件下，INSM1陽性率高于37 ℃ 1 h。對兩種實驗條件的檢測結(jié)果進行一致性分析發(fā)現(xiàn)，肺小細胞癌中兩者的一致性較好(κ=0.835 4)，肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和低級別神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的一致性較差(κ=0.286 8，κ=0.039 0)。

3 討論

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是一組異質(zhì)性較大的上皮源性腫瘤，可以表現(xiàn)為惰性的生物學行為，早期也可發(fā)生轉(zhuǎn)移，迅速播散。其共同特征為神經(jīng)和內(nèi)分泌分化，如具有分泌顆粒、突觸樣囊泡和分泌氨基酸或肽類激素等[7]。近期，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑依維莫司，經(jīng)美國食品藥品管理局批準用于晚期或進展期、分化好的無功能性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的治療，包括肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[8]。更多的藥物臨床實驗也在進行中。因此，對肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的精準診斷，成為臨床病理工作的重點。肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤包括典型類癌、非典型類癌、小細胞癌和大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌以及特發(fā)性彌散性神經(jīng)內(nèi)分泌細胞增生，占全部肺腫瘤的15%～20%[9]。從形態(tài)學特征分析，神經(jīng)內(nèi)分泌癌與肺腺癌和肺鱗癌有較大差異，而對于某些低分化癌，單純依據(jù)形態(tài)學難以鑒別。免疫組化染色能夠提供較大幫助。目前，臨床工作中通常開展Syn、CgA、CD56及TTF1用以鑒別肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤；但是一部分神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤不表達神經(jīng)內(nèi)分泌的相關(guān)標記。因此，結(jié)合已經(jīng)發(fā)表的相關(guān)研究結(jié)果，本實驗采用免疫組化EnVision兩步法探討INSM1在肺腫瘤中的表達模式，以期明確其臨床病理診斷價值。

作者檢測INSM1在196例肺腫瘤中的表達定位于細胞核，而傳統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌抗體(Syn、CgA和CD56)呈細胞質(zhì)或細胞膜著色。因此，INSM1比傳統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌標志物更容易判讀。在72例肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，63例可見INSM1陽性，陽性率為87.5%。在肺腺癌和肺鱗癌中只有個別出現(xiàn)弱陽性染色。在不進行統(tǒng)計分析的情況下，即可看出表達差異。本組納入的72例神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，包含26例小細胞癌，23例大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌，13例非典型類癌和10例典型類癌。依據(jù)預(yù)后及生物學行為，本實驗將非典型類癌和典型類癌合并為低級別神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤進行統(tǒng)計學分析。INSM1、Syn和CD56在小細胞癌中的敏感性均為88.5%，均顯著高于CgA。在大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，INSM1的敏感性和CD56相同，略低于Syn，但是顯著高于CgA。在肺類癌中，四者差異無顯著性。此外，INSM1的特異性顯著高于CD56，與CgA相似。雖然本實驗中INSM1的特異性和Syn差異無顯著性，INSM1在肺腺癌和肺鱗癌中的陽性率低于Syn，本組結(jié)論和Mukhopadhyay等的研究結(jié)果較為一致；但是在實驗條件相似的情況下，Mukhopadhyay等在肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中得到的陽性率(75%，18/24)低于Rooper等的研究結(jié)果(91.3%，21/23)。因此，本組結(jié)果更傾向于樣品本身的異質(zhì)性引起實驗結(jié)果的差異。每項實驗均檢測20余例樣本，數(shù)量尚少，因此也可能出現(xiàn)結(jié)論不一致。本組結(jié)果認為INSM1在大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的陽性率為78.3%(18/23)，雖然敏感性低于小細胞癌，但是與Syn的敏感性并無差異。

值得一提的是，以往研究多采用全自動免疫組化染色平臺進行制片。但是，國內(nèi)還有一定數(shù)量的醫(yī)院或第三方檢測機構(gòu)未引進全自動免疫組化染色平臺。因此，我們采用手工免疫組化染色法開展實驗。結(jié)果顯示，手工染色結(jié)果與以往多數(shù)文獻報道的數(shù)據(jù)相似。在37 ℃ 1 h孵育一抗，INSM1在肺小細胞癌、肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肺類癌中的陽性率為84.6%、52.2%和30%；顯著低于4 ℃過夜孵育一抗INSM1的陽性率。進一步行一致性分析發(fā)現(xiàn)，兩種檢測條件下，肺小細胞癌的一致性較好(κ=0.835 4)，肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和低級別神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的一致性較差(κ=0.286 8，κ=0.039 0)。有文獻報道一抗室溫孵育1 h和4 ℃過夜相比，其陽性細胞表達效果欠佳，可能由于抗原抗體結(jié)合不夠充分[20]?？乖涂贵w的結(jié)合反應(yīng)需要在最佳條件(如反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、抗體濃度等)下才能較好結(jié)合，單純的加快反應(yīng)速度可能無法達到化學反應(yīng)終點。因此，37 ℃的條件下孵育一抗可能在一定程度上降低INSM1的檢測敏感性，在臨床工作中應(yīng)慎用。

INSM1在胎兒發(fā)育過程中高表達，在胎兒出生后表達迅速下降，發(fā)育成熟的器官幾乎檢測不到INSM1[10]。當腫瘤形成后，INSM1又恢復(fù)表達。因此，INSM1與腫瘤關(guān)系也是值得探討的問題。如：(1)INSM1是否在腫瘤形成的過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用？(2)是否與患者預(yù)后相關(guān)？(3)是否成為新的治療靶點？本組采用的標本是近幾年的病例，隨訪時間較短，未討論INSM1的表達和患者預(yù)后的相關(guān)性。McColl等[21]研究認為，INSM1陰性的肺小細胞癌患者無瘤生存期明顯縮短，不表達INSM1的小細胞癌細胞系會出現(xiàn)化療抵抗，提示INSM1和肺小細胞癌患者的預(yù)后相關(guān)。Chen等[22]認為音猬因子(sonic hedgehog, SHH)信號通路通過N-myc和Ascl1激活I(lǐng)NSM1的表達，INSM1能夠進一步通過SHH通路增強N-myc的穩(wěn)定性。聯(lián)合選用多種不同的SHH信號通路抑制劑靶向抑制INSM1和N-myc，有可能是肺小細胞癌新的治療選擇。

本實驗中INSM1在同一病例中未發(fā)現(xiàn)與Syn及CD56有互補作用。檢索相關(guān)文獻，亦未見相關(guān)報道。但是鑒于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤類型較多，本組檢測標本有限，有必要在后續(xù)的實驗中加大樣本量進一步探討該問題。

總之，INSM1是一種較為可靠的肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤標志物，其敏感性和Syn及CD56相似，特異性與CgA無明顯差異。因此，INSM1可以作為傳統(tǒng)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤標志物的補充標記；甚至作為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤鑒別診斷的一線抗體單獨使用，以減少組織樣本的用量并節(jié)約檢測成本[17]。由于INSM1是細胞核著色抗體，在某些情況下(如細胞量少、存在廣泛壞死、標本擠壓等)比胞質(zhì)著色抗體更易判讀。但是INSM1免疫組化染色的研究尚屬早期，INSM1與Syn、CD56等標志物是否有互補作用尚需進一步分析，后期需進一步擴大樣本數(shù)量以及樣本類型，以明確INSM1在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達模式。