張進進，伭 婷，夏 輝，盛陳艷，麻寶藝，馬青霞，劉雅馨，高沙沙，杜 銳，冷 雪*，周 宇

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春130118； 2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118，3. 惠州海關(guān)，廣東惠州 516006)

近年來發(fā)現(xiàn)的宿主細胞受體和先天免疫反應(yīng)激活中的“危險信號”(存在于細菌、病毒和真菌中)的作用改變了我們對免疫學(xué)的理解[1]，在已知的激活機體先天免疫反應(yīng)的Toll樣受體(TLR)中，Toll樣受體9(TLR9)能夠識別細菌和病毒DNA中的非甲基化寡聚核苷酸(CpG ODN)基序，并通過誘導(dǎo)炎性細胞因子和I型干擾素(IFN)產(chǎn)生以Th1型為主的免疫應(yīng)答和CD8+細胞毒性T淋巴細胞應(yīng)答[2]。與細菌或病毒DNA相似，人們發(fā)現(xiàn)合成的CpG ODN能夠模擬天然CpG ODN的免疫刺激活性，誘導(dǎo)B細胞和漿細胞樣樹突狀細胞的增殖，分泌多種細胞因子、趨化因子和IgM[3-4]，從而激活人類、靈長類動物和其他動物的先天性免疫系統(tǒng)[5]。不同種類動物的TLR 9不同，與CpG ODN(A、B、C、P型CpG ODN)作用后誘導(dǎo)的信號通路有所差異，因此，CpG ODN發(fā)揮免疫活性具有種屬特異性。Kamstrup等研究表明，使用同樣的CpG ODN可以誘導(dǎo)豬外周血單個核細胞(PBMC)中IL-6和IL-12的表達和增殖[6]，但在小鼠實驗中未觀察到這種刺激作用[7]。諸多研究表明，CpG ODN在豬傳染性疾病的預(yù)防和治療方面具有潛力[8]。本研究對篩選構(gòu)建的CpG重組質(zhì)粒對豬PBMC的免疫刺激活性進行研究，為新型豬用疫苗分子佐劑的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 IMDM細胞培養(yǎng)液購自Gibco公司(批號：1967339)；胎牛血清(批號：TBD31HB)和豬外周血淋巴細胞分離液KIT(批號：LDS1108)均購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；ConA購自上海研生實業(yè)有限公司(批號：122H035)；MTS購自Promega公司(批號：313575)；質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司(批號：16018KA1)；豬IL-4 ELISA檢測試劑盒(批號：20190716)和豬IFN-γ ELISA檢測試劑盒(批號：20190716)均購自北京索萊寶科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EocRⅠ(批號：K2602AA)和Hind Ⅲ(批號：AH50858A)均購自TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 CpG ODN的設(shè)計與合成 根據(jù)對豬和人具有較好刺激活性的CpG基序ATCGAT、GTCGTT和GACGTT，設(shè)計并合成11條包含CpG單元的序列，其中，GC-ODN為不含CpG基序的陰性序列，全部CpG ODN的核酸骨架進行硫代修飾，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 CpG ODNs序列

1.2.2 豬PBMC的分離和培養(yǎng) 用75%酒精消毒4～6周齡健康未接種疫苗豬頸部皮膚，固定后從前腔靜脈無菌采血，用含肝素的無菌真空采血管收集血液。按照豬外周血單個核細胞分離液試劑盒使用說明，分離獲得豬PBMC。以1 mL的含10%胎牛血清IMDM營養(yǎng)液重懸細胞，取90 μL重懸所得的細胞并加入10 μL臺盼藍染色液，輕輕混勻，染色3 min；吸取少量經(jīng)過染色的細胞，在倒置顯微鏡下觀察并計算細胞數(shù)待用。

1.2.3 不同序列的CpG ODN刺激豬PBMC增殖能力檢測 使用含10%胎牛血清的IMDM營養(yǎng)液將豬PBMC濃度調(diào)至1×106/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。分別加入陰性對照GC-ODN和設(shè)計合成的11條CpG ODN序列，CpG ODN的終濃度為5 μg/mL；陽性對照孔加入ConA溶液，加入終濃度為5 μg/mL；空白組加入與CpG ODN等體積的PBS，每組3個復(fù)孔。將96孔細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)32 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL MTS溶液，培養(yǎng)結(jié)束后立即用酶標儀檢測各孔在490 nm波長的OD值，并計算刺激指數(shù)(SI值)，SI值計算公式如下：SI=(OD樣品-OD空白)/(OD陰性-OD空白)。

1.2.4 含CpG基序重組質(zhì)粒的合成和鑒定 以1.2.3項中篩選出的對豬PBMC具有較好刺激活性的CpG序列為核心，設(shè)計含6次重復(fù)的CpG序列，并在其兩側(cè)分別加入HindⅢ和EcoR I酶切位點，兩端含有酶切位點的雙鏈CpG ODN由寶生物(大連)有限公司合成并克隆入pUC19載體中，對獲得的重組質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序鑒定。

1.2.5 重組質(zhì)粒刺激豬PBMC增殖能力檢測 將提取的CpG ODN重組質(zhì)粒接種于含豬PBMC的96孔板，PBMC濃度為1×106/mL，每孔100 μL。質(zhì)粒終濃度分別為1、2.5、5和10 μg/mL，同時設(shè)陰性對照和空白對照，陽性對照孔加入5 μg/mL ConA溶液。按照1.2.3項中方法測定各孔在490 nm波長的OD值，并計算SI值。

1.2.6 細胞因子IL-4和IFN-γ檢測 將豬PBMC濃度調(diào)至1×106/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。將CpG ODN重組質(zhì)粒分別加入96孔細胞培養(yǎng)板，質(zhì)粒終濃度為5 μg/mL，空白組加入PBS，同時設(shè)不含CpG基序的質(zhì)粒作為對照，每個樣品設(shè)3個重復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔收集上清100 μL，按照豬IL-4 和IFN-γ ELISA檢測試劑盒說明書的操作步驟進行，根據(jù)標準曲線確定所測細胞因子的濃度。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果以平均值±標準差表示，組間均數(shù)比較采用完全隨機試驗方差分析的方法，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同序列CpG ODN刺激豬PBMC增殖能力檢測 結(jié)果見表2。使用不同序列CpG ODN刺激豬PBMC，除CpG04外，其他CpG ODN的SI值均大于2，其中CpG06、CpG07和CpG08的SI值分別為5.82、5.27和5.58，對豬PBMC具有較好的刺激活性。

表2 不同序列CpG ODN對豬PBMC刺激效果

2.2 CpG ODN重組質(zhì)粒酶切鑒定 以對豬PBMC具有較好刺激活性的CpG06和CpG08為核心，經(jīng)6次重復(fù)，兩端分別加入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點，合成并構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pCpG06和pCpG08。對獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定(圖1)，結(jié)果分別獲得約181 bp和158 bp的目的片段，與預(yù)期大小相符，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)進一步測序鑒定證明構(gòu)建正確。

M.Marker DL2000；1.pCpG06 Hind Ⅲ單酶切；2.pCpG06 EcoRI單酶切；3.pCpG06 Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切；4.pCpG08 Hind Ⅲ單酶切；5.pCpG08 EcoR I單酶切；6.pCpG08 Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切M.Marker DL2000；1.Enzyme digestion of pCpG06 by Hind Ⅲ；2.Enzyme digestion of pCpG06 by EcoR I；3.Enzyme digestion of pCpG06 by Hind Ⅲ and EcoR I；4.Enzyme digestion of pCpG08 by Hind Ⅲ；5.Enzyme digestion of pCpG08 by EcoR I；6.Enzyme digestion of pCpG08 by Hind Ⅲ and EcoR I

2.3 CpG ODN重組質(zhì)粒刺激豬PBMC增殖能力檢測 結(jié)果見表3。重組質(zhì)粒pCpG06和pCpG08接種豬PBMC后測得其SI值均大于2，且SI值隨質(zhì)粒濃度的增加而升高。當質(zhì)粒濃度為5 μg/mL以上時，重組質(zhì)粒pCpG06和pCpG08的SI值分別大于4和5，表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCpG06和pCpG08對豬PBMC具有較好的刺激活性。

表3 不同濃度CpG 重組質(zhì)粒對豬PBMC刺激效果

“-”：Blank control without SI value

2.4 細胞因子IL-4和IFN-γ檢測 用pCpG06和pCpG08重組質(zhì)粒分別刺激豬PBMC 24 h后，收集上清，檢測上清中IL-4和IFN-γ含量。圖2結(jié)果表明，pCpG06和pCpG08重組質(zhì)粒能夠促進豬PBMC高分泌細胞因子IL-4，而對IFN-γ的分泌沒有明顯影響。

圖2 CpG重組質(zhì)粒刺激豬PBMC后IL-4和IFN-γ分泌水平

3 討論和結(jié)論

在佐劑的研究中，人們逐漸認識到固有免疫對獲得性免疫的促進作用。CpG ODN是TLR9的激動劑，能刺激人及哺乳動物的天然免疫應(yīng)答，在作為疫苗佐劑、抗病毒及抗腫瘤方面顯示出應(yīng)用前景。小鼠體內(nèi)研究中已證實，CpG ODN能通過激活免疫反應(yīng)抵抗廣泛的病毒和其他微生物，如HBV、HIV、HSV、李斯特菌等的感染。Coley公司開發(fā)的C型CpG ODN 10101具有劑量依賴性地降低HCV感染者血中病毒RNA水平的作用，患者耐受性良好[9]。CpG ODN 7909用作乙肝疫苗佐劑的臨床試驗顯示，接種疫苗和7909混合物的受試者血清中抗原特異性的抗體出現(xiàn)更早，滴度更高[10]。我國朱鴻飛等將設(shè)計合成的CpG序列與pUC18載體鏈接，獲得的重組質(zhì)粒與豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)活疫苗聯(lián)合使用，能夠有效提高PRRS特異性抗體和細胞因子水平，提高疫苗的免疫保護效果[8]。

CpG ODN能以TLR9依賴的方式刺激機體的固有免疫應(yīng)答，通常用于TLR9應(yīng)答研究[11]。 已有報道表明，用不同CpG ODNs體外刺激3種豬源細胞，都能夠使豬源細胞TLR9相關(guān)信號通路分子的轉(zhuǎn)錄水平升高，分別可作為潛在的豬Th1/Th2、Th1和Th2型免疫反應(yīng)特異性誘生劑促進不同類型細胞因子的表達[12]。本研究根據(jù)對豬和人具有較好刺激活性的CpG基序ATCGAT、GTCGTT和GACGTT，設(shè)計并合成11條CpG序列，除CpG04外，其他CpG ODN的SI值均大于2。其中CpG06和CpG08的SI值最高，分別為5.82和5.58，對豬PBMC具有較好的刺激活性。以CpG06和CpG08為核心基序，分別合成6次重復(fù)序列，并連接入pUC19載體，獲得的重組質(zhì)粒pCpG06和pCpG08對豬PBMC均具有較好的刺激活性，SI值分別可達4.97和5.32。同時能夠刺激豬PBMC產(chǎn)生較高水平的IL-4，而對IFN-γ的產(chǎn)生無明顯刺激活性，這與部分CpG對免疫活性細胞的刺激作用研究結(jié)果一致[13]，而針對于其他細胞因子的促進作用仍有待于進一步研究，進而確定其所適用的疫苗類型。

總之，本研究獲得的含CpG基序重組質(zhì)粒pCpG06和pCpG08對豬PBMC具有較好的刺激活性，并可刺激豬PBMC產(chǎn)生較高水平的IL-4，為CpG重組質(zhì)粒作為疫苗佐劑的研究奠定了試驗基礎(chǔ)。