許藝凡，周冰，張聰，姚路路，楊會鮮，周德剛，張曉會

(國家獸用藥品工程技術研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，河南洛陽 471000)

芩黃顆粒是由黃芩、板藍根、麻黃、山豆根、甘草、桔梗等六味中藥組成的中獸藥制劑，該方由《傷寒論》“麻杏甘石湯”藥味加減而來，目前收載于《獸藥質(zhì)量標準》2017年版。方中黃芩性寒、味苦，有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血除熱的作用，可治療肺熱咳嗽、濕熱瀉痢；甘草性平、味甘，有和中緩急、潤肺解毒的功效，可治療咽喉腫痛、肺痿咳嗽等癥。該藥在臨床上主要用于雞傳染性支氣管炎的預防與輔助性治療[1]。目前，芩黃顆粒質(zhì)量標準中含量測定項分別對黃芩苷與甘草酸進行測定，也有學者單獨研究了芩黃顆粒中甘草酸或黃芩苷的含量測定方法[2-3]，但未見有同時測定黃芩苷與甘草酸含量的相關報道。本研究首次建立了同時測定芩黃顆粒中黃芩苷和甘草酸含量的高效液相色譜方法，該方法簡便、準確，可以提高該制劑在實際生產(chǎn)中的檢驗效率，為該制劑的質(zhì)量控制提供了參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，配備2489型紫外檢測器；AB265-S電子分析天平，METTLER TOLEDO 公司；KQ-500DB超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 黃芩苷對照品(批號110715-201720，含量：93.52%，中國食品藥品檢定研究院)；甘草酸銨對照品(批號110731-201720，含量：94.3%，中國食品藥品檢定研究院)；芩黃顆粒(洛陽惠中獸藥有限公司，批號：20190704、20190705、20190706，規(guī)格：500 g /袋)；乙腈、甲醇均為色譜純，Thermo Fisher Scientific公司；磷酸為分析純，天津大茂化學試劑廠；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：以乙腈為流動相A，0.05 %磷酸溶液為流動相B，按表1進行梯度洗脫；檢測波長：252 nm；柱溫30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取黃芩苷對照品、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，置于同一量瓶中，用適量甲醇使溶解，再加入50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照溶液(黃芩苷濃度為0.3092 mg/mL、甘草酸銨濃度為0.0413 mg/mL)(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207)。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取處方中去除甘草、黃芩的其他藥材，按芩黃顆粒處方比例和工藝制備陰性對照樣品，按2.2.2項方法，制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1～圖3)。結果表明：供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應的位置上，有相同保留時間的色譜峰，且陰性無干擾，表明本方法專屬性良好。

圖1 對照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

圖3 陰性色譜圖

2.4 線性關系考察 分別稱取黃芩苷對照品、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，置于同一量瓶中，用適量甲醇使溶解，再加入50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品儲備液(黃芩苷濃度0.6184 mg/mL、甘草酸銨濃度0.08256 mg/mL)。精密量取混合對照品儲備液1、2、3、5、8 mL于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成線性對照溶液。分別精密吸取上述不同濃度的混合對照品溶液和對照品儲備液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸，得黃芩苷的回歸方程為：Y=12148X+2018.7，R2=0.9999；甘草酸的回歸方程為：Y=8209.8X+463.92，R2=0.9999。表明黃芩苷的進樣濃度在61.84～618.4 μg/mL的范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好；甘草酸的進樣濃度在8.256～82.56 μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取2.2.1項的混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，測得黃芩苷、甘草酸峰面積的RSD分別為0.5%、0.5%(n=6)。表明儀器精密度較好(表2)。

表2 精密度實驗

2.6 重復性試驗 取批號20190706本品6份，精密稱定，按2.2.2項方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，依法測定，結果黃芩苷、甘草酸的平均含量分別為31.2、4.8 mg/g，RSD分別為0.9%、1.0%(n=6)，結果表明，本法具有較好的重復性。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取本品，精密稱定，按2.2.2項制備供試品溶液，分別于第0、2、4、6、8、10、12 h各精密吸取10 μL注入液相色譜儀，依法測定，結果黃芩苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.3%、0.4%。結果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(表3)。

表3 穩(wěn)定性試驗

2.8 加樣回收試驗 取已知含量樣品(批號：20190706)6份，每份約0.25 g，精密稱定，按樣品含量的100%分別加入黃芩苷和甘草酸對照品儲備液，按2.2.2項方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，依法測定，結果黃芩苷、甘草酸的平均加樣回收率分別為100.0%、99.2%，RSD分別為1.0 %、0.6%(n=6)，表明方法準確度良好(表4、表5)。

表4 黃芩苷加樣回收率

表5 甘草酸加樣回收率

2.9 樣品測定 取芩黃顆粒3批(批號：20190704、20190705、20190706)，按2.2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件分別測定樣品中黃芩苷和甘草酸的含量，三批樣品的含量測定結果見表6。

表6 樣品含量測定結果

3 討論與結論

3.1 檢測波長的選擇 分別取黃芩苷與甘草酸對照品溶液，采用紫外光分光光度法進行全波長掃描，結果黃芩苷的最大吸收波長為277 nm、甘草酸的最大吸收波長為252 nm。且兩個成分在波長為263 nm處均具有較大的吸收。取供試品溶液，分別在263 nm和252 nm波長下依法測定，結果，在252 nm波長下，甘草酸峰的響應較263 nm下更高，因芩黃顆粒中黃芩苷的含量遠高于甘草酸的含量，為使兩種成分同時有較好的檢出靈敏度，綜合考慮，最終選擇252 nm作為檢測波長(圖4)。

圖4 紫外全波長掃描圖

3.2 流動相的選擇 參考《中國獸藥典》2015年版二部甘草含量測定項下條件，采用乙腈-0.05%磷酸為流動相進行試驗[4]，同時根據(jù)文獻報道，分別考察了乙腈-0.05%磷酸溶液[5-6]、甲醇-0.1%磷酸溶液[7]、乙腈-0.1%磷酸溶液[8]、甲醇-0.05%磷酸溶液等流動相體系。最終選擇乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動相進行梯度洗脫，主峰的分離效果較好，且基線較平穩(wěn)，適用于黃芩苷與甘草酸的同時測定。

本文采用高效液相法同時測定了芩黃顆粒中黃芩苷與甘草酸的含量，該方法簡便，準確、重復性好，對提高實際生產(chǎn)檢驗效率及本產(chǎn)品質(zhì)量控制具有重要意義。