左三齡，張 博，邱銀生，葉 純，吳仲元

(武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，武漢 430023)

目前國內(nèi)外豬場(chǎng)普遍存在蒼蠅污染問題，養(yǎng)殖場(chǎng)蠅蛆的控制是困擾養(yǎng)殖生產(chǎn)的一大難題?？刂撇呗灾饕鞘褂脭硵澄泛统x菊噴霧劑，但毒副作用較大[1]。除蟲脲(diflubenzuron)，化學(xué)名1-(4-氯苯基)-3-(2,6-二氟苯甲?；?脲(圖1)。屬苯甲酰脲類殺蟲劑，作用性質(zhì)為昆蟲生長調(diào)節(jié)劑，能夠阻礙昆蟲表皮中幾丁質(zhì)的合成，使昆蟲變態(tài)受阻不能蛻皮而死亡[2-3]。獸用除蟲脲作用方式主要為胃毒和觸殺，無內(nèi)吸收特性[4]。除蟲脲的合成路線有多種[5-7]，主要合成工藝為2,6-二氟苯甲酰胺與對(duì)氯苯基異氰酸酯在二甲苯溶液中縮合生成除蟲脲。該農(nóng)藥于1976年，經(jīng)美國環(huán)保局批準(zhǔn)投入批量生產(chǎn)[8]，2016年1月美國Central Life Sciences公司已開發(fā)出0.04%和0.67%的獸用除蟲脲預(yù)混劑Mix Clarifly?作為豬、牛和馬的殺蠅蛆劑使用，但目前國內(nèi)無相關(guān)獸藥制劑，且國內(nèi)外對(duì)其原料藥含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)檢查少有相關(guān)報(bào)道。為完善獸用除蟲脲的質(zhì)量控制，本研究擬通過使用高效液相色譜(HPLC)建立獸用除蟲脲含量測(cè)定及其有關(guān)物質(zhì)檢查的方法，以期為國內(nèi)外進(jìn)一步的獸用制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制研究提供參考。

圖1 除蟲脲結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(ACQUITY Arc HPLC)配備二極管陣列(PDA)檢測(cè)器，購自美國Waters公司；精密分析天平(BS 110S)，購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；超純水儀購自德國 Merck-Millipore公司；渦旋混合儀(FW80微型)購自上海滬西分析儀器廠有限公司；pH計(jì)(STARTER 2100)購自奧豪斯儀器上海有限公司；超聲儀(KQ5200)購自昆山市超聲儀器有限公司；藥物穩(wěn)定性檢查儀(WD-A)購自天津天光光學(xué)儀器有限公司。

除蟲脲對(duì)照品(批號(hào)G139525，含量≥99.2%)購自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；3批獸用除蟲脲原料藥(自制，批號(hào)2018090201、2018090202、2018090203)；除蟲脲可能的雜質(zhì)(表1)：A、B、C、D(含量均大于98.0%)購自MACKLIN公司；甲醇、乙腈(色譜純)購自Fisher Cheical公司；乙酸銨、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 除蟲脲可能的雜質(zhì)

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法與結(jié)果

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)，檢測(cè)波長為254 nm，流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，以甲醇為流動(dòng)相A，0.01 mol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫順序?yàn)? min，40% A；0～5 min，40% A；5～20 min，40%～80% A；20～30 min，80% A；30～35 min，80%～40% A；35～40 min，40% A。

2.1.2 溶液配制 除蟲脲儲(chǔ)備液的制備：分別精密稱量除蟲脲對(duì)照品和原料藥100 mg，加甲醇溶解，制成濃度為1000 μg/mL的除蟲脲對(duì)照品和原料藥儲(chǔ)備溶液，4 ℃冷藏備用。

2.1.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 將2.1.2項(xiàng)除蟲脲對(duì)照品和原料藥的儲(chǔ)備液，分別用甲醇稀釋為100 μg/mL，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。計(jì)算得到的主峰理論塔板數(shù)均大于25000，各組分的分離度均大于1.5，符合規(guī)定。

圖2 除蟲脲對(duì)照品(A)和原料藥(B)的HPLC圖譜

2.1.4 線性關(guān)系考察 將2.1.2項(xiàng)除蟲脲對(duì)照品溶液，用甲醇分別稀釋為10、20、50、100、200、500 μg/mL，以質(zhì)量濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)作線性回歸，得線性回歸方程為y=28 812C-1 957.7，R2=0.999。表明除蟲脲質(zhì)量濃度在10～500 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 重復(fù)性、精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn) 根據(jù)《中華人民共和國獸藥典(2015版)》一部的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法指導(dǎo)原則，精密稱取6份10 mg的除蟲脲對(duì)照品，用甲醇溶解定容至100 mL，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD=0.45%，表明本方法重復(fù)性良好；將質(zhì)量濃度為100 μg/mL的除蟲脲對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣9次，計(jì)算可得其RSD=0.13%，表明本方法精密度良好；又分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣記錄峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于0 h時(shí)的除蟲脲的降解率為0.51%，RSD=0.20%，表明在常溫條件下，24 h內(nèi)除蟲脲原料藥溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.6 回收率試驗(yàn) 加入除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制80%、100%、120%的供試溶液，每個(gè)3份，用外標(biāo)法計(jì)算平均回收率及RSD?；厥章蕿?7.01%～100.83%，RSD<1.0%(n=3)，符合回收率要求。

2.1.7 含量測(cè)定 取三批除蟲脲原料藥配制供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，并記錄峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算除蟲脲的含量。三批除蟲脲原料藥的含量分別為99.73%(2018090201)、99.61%(2018090202)、99.67%(2018090203)。

2.2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法與結(jié)果

2.2.1 色譜條件 同2.1.1項(xiàng)色譜條件。

2.2.2 溶液配制 據(jù)文獻(xiàn)[9]及除蟲脲合成原料及工藝中發(fā)現(xiàn)可能的雜質(zhì)有A、B、C、D。其中C(對(duì)氯苯基異氰酸酯)需進(jìn)行衍生化處理成在流動(dòng)相中穩(wěn)定的物質(zhì)，再進(jìn)樣檢測(cè)。根據(jù)文獻(xiàn)[10-12]衍生化方法，C與甲醇進(jìn)行酯化反應(yīng)。

供試品溶液：稱取除蟲脲及其有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D各0.05 g，將C衍生化處理后與A、B、D混合于100 mL量瓶中，加甲醇定容，制成質(zhì)量濃度均為500 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 將2.2.2項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，色譜圖見圖3。計(jì)算得到的理論塔板數(shù)均大于25000，各組分的分離度良好，均大于1.5，符合規(guī)定。

1：2,6-二氟苯酰胺；2：對(duì)氯苯胺；3：對(duì)氯苯基異氰酸酯；4：除蟲脲；5：1,3-雙(4-氯苯基)尿素

2.2.4 專屬性與破壞性試驗(yàn) 分別精密稱取5份除蟲脲原料藥0.05 g于100 mL量瓶中，處理如下：①氧化破壞：加入30%過氧化氫1 mL，超聲20 min；②酸破壞：加入1 mol/L鹽酸溶液(溶劑甲醇)70 mL，90 ℃水浴加熱100 min；③堿破壞：加入1 mol/L氫氧化鈉溶液70 mL，90 ℃水浴加熱100 min；④高溫破壞：于105 ℃放置10 h；⑤光照破壞：室溫下，5 000±500 Lux強(qiáng)光照放置14 h，自然光照放置10 d。將未經(jīng)降解試驗(yàn)的原料藥和降解破壞樣品加甲醇，完全溶解后，酸堿破壞樣品分別中和后甲醇定容，進(jìn)樣測(cè)定。專屬性和破壞試驗(yàn)的結(jié)果見圖4和表2?？梢娢唇?jīng)破壞除蟲脲原料藥的相對(duì)保留時(shí)間(Rt)為28.437 min，氧化破壞則主要產(chǎn)生了降解物R1(Rt為1.404 min)，酸堿、高溫和自然光破壞條件下產(chǎn)生了降解物R2(Rt為10.411 min)，強(qiáng)光和自然光條件下產(chǎn)生了降解物R3(Rt為29.624 min)，強(qiáng)光下主要產(chǎn)生了降解物R4(Rt為31.802 min)。根據(jù)PDA掃描光譜圖，可知除蟲脲主峰和主要降解物R1、R2、R3、R4均為單一純度峰。各降解產(chǎn)物與主峰的分離度R均大于1.5，符合要求，說明該方法良好。

A.空白溶劑；B.未經(jīng)破壞原料藥；C.氧化破壞；D.強(qiáng)酸破壞；E.強(qiáng)堿破壞 F.高溫破壞；G.強(qiáng)光破壞；H.自然光破壞A.Blank solvent；B.Untreated raw material drug；C.Destroyed by oxidation；D.Destroyed by acid；E.Destroyed by alkali；F.Destroyed by heat；G.Destroyed by strong light；H.Destroyed by natural light

表2 破壞試驗(yàn)的有關(guān)物質(zhì)

其中對(duì)氯苯胺與強(qiáng)堿、強(qiáng)酸、高溫和自然光破壞產(chǎn)生的降解物R2的PDA掃描光譜圖見圖5，對(duì)比后發(fā)現(xiàn),R2與對(duì)氯苯胺的出峰時(shí)間和最佳波長幾乎一致，有理由懷疑R2為對(duì)氯苯胺。PDA掃描圖譜的對(duì)比分析為除蟲脲有關(guān)物質(zhì)的定性檢測(cè)提供了參考依據(jù)。

A.對(duì)氯苯胺；B. 強(qiáng)堿破壞；C. 強(qiáng)酸破壞；D. 高溫破壞；E. 自然光破壞A.4-Chlorophenyamine；B. Destroyed by alkali；C. Destroyed by acid；D. Destroyed by heat；E. Destroyed by natural light

2.2.5 雜質(zhì)檢測(cè)限與定量限 將2.2.2項(xiàng)混合對(duì)照溶液，用甲醇逐步稀釋后進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比S/N=3、S/N=10測(cè)定，雜質(zhì)A、B、C、D檢測(cè)限分別為0.5244、1.5261、0.4691、0.0997 μg/mL(S/N=3)，定量限分別為1.7479、5.0869、1.5638、0.3324 μg/mL(S/N=10)。

2.2.6 樣品溶液精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn) 將2.2.2項(xiàng)混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣9次，計(jì)算得A～D雜質(zhì)峰面積的RSD分別為0.29%、0.42%、0.73%、0.45%；每天進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6 d，計(jì)算得A～D雜質(zhì)峰面積的RSD分別為0.83%、1.78%、2.31%、1.88%。并分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，計(jì)算得不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)A～D雜質(zhì)峰面積的RSD分別為0.60%、1.07%、1.89%、1.26%。表明在常溫條件下，本方法日內(nèi)、日間精密度良好，12 h內(nèi)除蟲脲原料藥溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.7 有關(guān)物質(zhì)檢查 取三批除蟲脲原料藥，按照2.2.2項(xiàng)的方法配制供試品溶液濃度為500 μg/mL進(jìn)樣測(cè)定并記錄峰面積。測(cè)定結(jié)果如表3所示，用外標(biāo)法計(jì)算除蟲脲主成分含量均大于99%，以主成分自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)雜質(zhì)的量，原料藥雜質(zhì)峰面積的總和均低于0.1%的鑒定限。

表3 除蟲脲主成分含量和有關(guān)雜質(zhì)

3 討論與結(jié)論

3.1 衍生化方法的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)[10-12]發(fā)現(xiàn)對(duì)氯苯基異氰酸酯在含有水相的溶液中不穩(wěn)定，易水解，進(jìn)樣后在流動(dòng)相中會(huì)發(fā)生水解影響檢測(cè)，需要在進(jìn)樣前進(jìn)行衍生化處理成在流動(dòng)相中相對(duì)穩(wěn)定的物質(zhì)后，再進(jìn)樣檢測(cè)。衍生化方法分別考察了兩種常見的方法：一為對(duì)氯苯基異氰酸酯用四氫呋喃溶解后用過量二正丁胺進(jìn)行衍生；二為用甲醇與對(duì)氯苯基異氰酸酯進(jìn)行酯化反應(yīng)的衍生方法。其中衍生化方法二的處理過程簡單,易反應(yīng)完全，且無溶劑峰和雜峰，不影響除蟲脲及相關(guān)雜質(zhì)的分析。因此，選擇了甲醇與對(duì)氯苯基異氰酸酯進(jìn)行酯化反應(yīng)的衍生方法。

3.2 色譜條件的選擇 本試驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[13-15]，流動(dòng)相分別考察了乙腈-水-二惡烷、甲醇-水、甲醇-乙酸銨水這3種流動(dòng)相體系。結(jié)果顯示在乙腈-水-二惡烷的流動(dòng)相條件下，對(duì)氯苯基異氰酸酯的峰型不佳,有拖尾且各峰分離不佳；在甲醇-水的流動(dòng)相條件下，2,6-二氟苯甲酰胺的峰型不佳,有拖尾且各峰分離一般；甲醇-乙酸銨水的流動(dòng)相條件下，除蟲脲與2,6-二氟苯甲酰胺、對(duì)氯苯基異氰酸酯、對(duì)氯苯胺及1,3-雙(4-氯苯基)尿素的峰型良好且各峰分離良好。因此,選擇甲醇-乙酸銨水作為流動(dòng)相體系。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將流動(dòng)相等度洗脫調(diào)整為梯度洗脫后，既能短時(shí)高效的檢測(cè)出獸用除蟲脲原料藥是否引入其合成工藝上的雜質(zhì)，同時(shí)能測(cè)定出主成分含量和有關(guān)物質(zhì)，且各峰分離度良好。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長調(diào)整為254 nm時(shí)，各峰響應(yīng)值均較高。

3.3 PDA檢測(cè)色譜圖分析 通過破壞性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了除蟲脲的多種有關(guān)物質(zhì)，將降解產(chǎn)物R2和對(duì)氯苯胺的PDA檢測(cè)色譜圖進(jìn)行對(duì)比分析，兩張圖譜最佳波長幾乎一致，光譜學(xué)上說明強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和自然光破壞條件下的降解物R2為對(duì)氯苯胺，若完全確定,可做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)確證研究，其生成途徑也有待進(jìn)一步的解析。

藥物有關(guān)物質(zhì)的檢查與鑒定在其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定實(shí)施中十分的重要，但目前除蟲脲未被藥典收錄且無有關(guān)物質(zhì)的控制標(biāo)準(zhǔn)。本研究對(duì)除蟲脲含量和有關(guān)物質(zhì)液相方法建立的同時(shí)，對(duì)其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了初步的研究。本研究發(fā)現(xiàn)3批次的除蟲脲原料藥中總雜質(zhì)最大限度為0.1%，均低于《獸用化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中獸醫(yī)專用原料藥的雜質(zhì)報(bào)告限度0.1%，鑒定限度0.2%，質(zhì)控限度0.5%的標(biāo)準(zhǔn)。因此,依據(jù)現(xiàn)行傳統(tǒng)工藝水平可暫定為如有雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)峰面積的面積和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.1倍(0.1%)。本研究建立測(cè)定除蟲脲原料藥主成分含量及有關(guān)雜質(zhì)的高效液相色譜法，使除蟲脲及有關(guān)雜質(zhì)在同一色譜條件下檢測(cè)并取得良好的分離效果，PDA檢測(cè)圖譜為除蟲脲有關(guān)物質(zhì)的定性分析提供了參考依據(jù)。該方法含量測(cè)定準(zhǔn)確靈敏，雜質(zhì)分離度好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作獸用除蟲脲原料藥主成分含量及有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)與分析，為獸用除蟲脲原料藥的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了參考依據(jù)。