羅思思，謝芝勛，李孟，黃嬌玲，李丹，謝麗基，張民秀，曾婷婷，王盛，張艷芳，范晴，謝志勤，鄧顯文

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV) 屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，是單股、分節(jié)段的RNA病毒，編碼8個(gè)基因(PB1、PB2、PA、HA、NA、M、NP和NS)。根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性的不同，目前已發(fā)現(xiàn)18個(gè)HA亞型和11個(gè)NA亞型[1]。部分H5和H7亞型為高致病性AIV(Highly pathogenic AIV, HPAIV)，可引起家禽大規(guī)模死亡，并可傳染給人[2]。大多數(shù)亞型AIV均為低致病性AIV(Low pathogenic AIV, LPAIV)。

H4亞型AIV屬于LPAIV，在流感調(diào)查項(xiàng)目中，發(fā)現(xiàn)H4亞型AIV?？煞蛛x到，已作為常分離出的主要亞型之一[3-5]。N2亞型AIV是最常見(jiàn)的NA亞型。快速檢測(cè)H4、N2和所有亞型AIV的方法對(duì)于AIV的防控具有重要意義。目前，檢測(cè)AIV的方法多為病毒分離鑒定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但存在操作步驟較多、耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，而在實(shí)際應(yīng)用中更需要簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)方法。多重PCR是在普通PCR基礎(chǔ)上建立起來(lái)的，即在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)目的基因同時(shí)擴(kuò)增，具有快速、簡(jiǎn)便、成本低、可同時(shí)檢測(cè)和鑒別多種病原體等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)[6-8]。本研究旨在利用多重RT-PCR技術(shù)，建立一種特異、敏感、簡(jiǎn)便和快速檢測(cè)H4、N2和所有亞型AIV的三重RT-PCR方法。

1 材料與方法

1.1 毒株和主要試劑 不同亞型AIV(H1N1、H1N2、H3N2、H3N6、H3N8、H4N2、H4N6、H5N2、H6N2、H6N6、H7N2、H9N2)、新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV4)由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所分離保存；AIV毒株的RNA(H5N2、H7N2)由美國(guó)康涅狄格州立大學(xué)惠贈(zèng)；傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus, ILTV)、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus, ARV)和雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum, MG)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2購(gòu)自TaKaRa公司；SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 在GenBank基因庫(kù)中下載H4亞型AIV HA基因、N2亞型AIV NA基因和所有亞型AIV M基因序列，應(yīng)用DNAstar軟件比對(duì)序列，找出保守區(qū)域。針對(duì)保守序列，在Primer Premier 5.0軟件掌握序列片段的Tm、錯(cuò)配和二聚體等信息，從而設(shè)計(jì)和篩選引物，初步篩出的引物經(jīng)NCBI-BLAST模擬驗(yàn)證特異性，最終得出候選引物，發(fā)至廣州Invitrogen公司合成。通過(guò)實(shí)際試驗(yàn)的驗(yàn)證，表1中的3對(duì)特異性引物可在同一反應(yīng)體系混合使用，用于同時(shí)檢測(cè)H4、N2和所有亞型AIV。

1.3 病毒核酸提取與三重RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化參照DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，抽提病毒RNA或DNA。一步法RT-PCR反應(yīng)體系25 μL：2×1 Step Buffer 12.5 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，H4、N2和AIV-M 三對(duì)引物終濃度在0.1～1 μmol/L之間調(diào)整，RNA 2 μL，以無(wú)RNA酶的超純水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序如下：50 ℃ 30 min, 94 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s, 50 ℃ ～ 65 ℃之間調(diào)整 40 s, 72 ℃ 40 s, 35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表1 引物信息

1.4 三重RT-PCR特異性試驗(yàn) 用該法對(duì)H4N2亞型AIV不同分離株、H4Ny(y≠2)亞型AIV (H4N6)、HxN2(x≠4)亞型AIV(H1N2、H3N2、H5N2、H6N2、H7N2、H9N2)、HxNy(x≠4，y≠2)亞型AIV (H1N1、H3N6、H3N8、H6N6)、NDV、IBV、ILTV、ARV、FAdV4、MG的RNA/DNA進(jìn)行三重RT-PCR檢測(cè)，檢驗(yàn)該法的特異性。

1.5 三重RT-PCR敏感性試驗(yàn) 測(cè)定H4N2亞型AIV的RNA濃度，將RNA倍比稀釋為6 ng/μL、600 pg/μL、60 pg/μL、6 pg/μL、600 fg/μL、60 fg/μL和6 fg/μL。用該法分別對(duì)各濃度RNA進(jìn)行三重RT-PCR的檢測(cè)，檢驗(yàn)該法的敏感性。

1.6 三重RT-PCR臨床樣品檢測(cè) 用該法對(duì)從廣西南寧市活禽市場(chǎng)采集的185份咽喉和泄殖腔棉拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，將棉拭子溶液接種至9～11日齡SPF雞胚，35 ℃孵育24～120 h進(jìn)行病毒增殖與分離，收集尿囊液，用血凝試驗(yàn)(HA)對(duì)其進(jìn)行鑒定，對(duì)有血凝性的樣品進(jìn)一步用血凝抑制試驗(yàn)(HI)鑒定出H亞型。對(duì)已確定H亞型的樣品，提取病毒RNA，參照文獻(xiàn)[9]的HA和NA基因全長(zhǎng)引物，擴(kuò)增和克隆HA和NA基因并送廣州Invitrogen公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果 經(jīng)過(guò)對(duì)引物之間濃度的優(yōu)化，H4-F和H4-R引物終濃度為0.6 μmol/L，N2-F和N2-R引物終濃度為0.4 μmol/L，AIV-M-F和AIV-M-R引物終濃度為0.3 μmol/L。退火溫度優(yōu)化結(jié)果表明,最佳退火溫度為56 ℃。

2.2 特異性結(jié)果 圖1顯示，用該法對(duì)H4N2亞型AIV的檢測(cè)出現(xiàn)3個(gè)目的條帶，分別為454 bp(H4亞型AIV)、282 bp(N2亞型AIV)和 167 bp(所有亞型AIV通用檢測(cè))；對(duì)H4Ny(y≠2)亞型AIV (H4N6)檢測(cè)出現(xiàn)2個(gè)目的條帶，分別為454 bp和167 bp；對(duì)HxN2(x≠4)亞型AIV(H1N2、H3N2、H5N2、H6N2、H7N2和H9N2)的檢測(cè)出現(xiàn)2個(gè)目的條帶，分別為282 bp和167 bp；對(duì)HxNy(x≠4，y≠2)亞型AIV(H3N6、H3N8、H6N6)的檢測(cè)只有167 bp目的條帶；對(duì)常見(jiàn)禽病病原體(NDV、IBV、ILTV、ARV、FAdV4和MG)的檢測(cè)無(wú)擴(kuò)增條帶；結(jié)果與實(shí)際相符。

M. DL1000 DNA Marker；1-3. H4N2亞型AIV不同分離株；4. H1N1；5. H1N2；6. H3N2；7. H3N6；8. H3N8；9.H4N6；10.H5N2；11. H6N2；12. H6N6；13. H7N2；14. H9N2；15.NDV；16.IBV；17.ILTV；18. ARV；19. FAdV4；20. MG；21. 陰性對(duì)照

2.3 敏感性結(jié)果 用該法對(duì)H4N2亞型AIV不同濃度的RNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)6 ng/μL ～6 pg/μL濃度的RNA，H4、N2、AIV-M引物均能檢測(cè)到；對(duì)600 fg/μL濃度的RNA，H4、N2、AIV-M引物均檢測(cè)不到，無(wú)條帶。因此，該法至少能檢測(cè)到6 pg/μL的RNA。

2.4 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 用所建立的方法對(duì)185份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。有3份樣品擴(kuò)增出3條特異性條帶，表明為H4N2亞型AIV；有1份樣品擴(kuò)增出454 bp和167 bp的2條特異性條帶，表明為H4亞型AIV；有7份樣品擴(kuò)增出282 bp和167 bp的2條特異性條帶，表明為N2亞型AIV；有8份樣品均出現(xiàn)167 bp的單一條帶，表明為其他亞型AIV(非H4和N2亞型)；其他166份樣品均無(wú)任何條帶，表明不是AIV。上述樣品通過(guò)病毒分離、血凝抑制試驗(yàn)和進(jìn)一步測(cè)序鑒定，結(jié)果與上述相符。

M: DL1000 DNA Marker；1: 6 ng/μL；2: 600 pg/μL；3: 60 pg/μL；4: 6 pg/μL；5: 600 fg/μL；6: 60 fg/μL；7: 陰性對(duì)照

表2 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

H4亞型AIV自1956年首次在捷克從鴨中分離出，之后廣泛分布于亞洲、歐洲和北美洲[10-12]。水禽和濱鳥(niǎo)是H4亞型AIV的主要宿主，并可感染海獅、馬和豬等哺乳動(dòng)物[13-14]。在全球流感檢測(cè)中，H4亞型分離率較高，在野鳥(niǎo)中廣泛流行[15]；在我國(guó)中部、東部和南部的活禽市場(chǎng)廣泛傳播，并發(fā)現(xiàn)該亞型與其他亞型進(jìn)行復(fù)雜基因重組[3-5]。有研究報(bào)道，H4N6和H9N2共感染的家禽可導(dǎo)致高頻的基因重組，重組病毒比野生型病毒毒力更強(qiáng)[16]。雖然尚未有H4致死人和導(dǎo)致家禽大規(guī)模死亡的案例，但根據(jù)流行調(diào)查結(jié)果，警惕我們需要定期監(jiān)測(cè)該亞型的流行態(tài)勢(shì)和遺傳進(jìn)化情況。H4亞型AIV在流感病毒進(jìn)化中起的作用不容忽視[17]。N2亞型是主要的NA亞型，常與H1、H3、H4、H6、H9等搭配組合，H4N2是常見(jiàn)的組合。因此，對(duì)于目前AIV的防控，建立一種H4、N2和所有亞型AIV的檢測(cè)方法十分迫切。

本研究成功建立了H4、N2和所有亞型AIV的三重RT-PCR檢測(cè)方法，關(guān)鍵在于3對(duì)特異性引物的設(shè)計(jì)。分別針對(duì)H4、N2亞型AIV的 HA和NA基因保守序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)型特異性引物，用于H4、N2亞型AIV的檢測(cè)；M基因在所有亞型AIV的進(jìn)化中較為保守，針對(duì)M基因設(shè)計(jì)了1對(duì)型通用引物，用于所有亞型AIV的檢測(cè)。由于3對(duì)引物混合在同一反應(yīng)體系使用，因此在設(shè)計(jì)引物時(shí)需考慮各擴(kuò)增片段至少相差100 bp，各引物之間無(wú)非特異性反應(yīng)和錯(cuò)配，避免競(jìng)爭(zhēng)性的擴(kuò)增。建立的三重RT-PCR方法首先檢查是否存在AIV的感染，同時(shí)確定是否存在H4、N2亞型的感染；其次，如無(wú)H4、N2亞型AIV感染，可確定是否存在其他亞型AIV的感染，為進(jìn)一步診斷提供參考依據(jù)。該法的局限性在于只能判定是否存在H4N2、H4Ny和HxN2亞型AIV的感染，并可輔助確定是否存在其他亞型AIV的感染，但無(wú)法確定是否存在混合感染的情況(H4N2與H4Ny、H4N2與HxN2、H4N2與HxNy、H4Ny與HxNy等)。

本研究通過(guò)設(shè)計(jì)和篩選3對(duì)特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立同時(shí)檢測(cè)H4、N2和所有亞型AIV的三重RT-PCR方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低和省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)，為有效防控AIV提供技術(shù)支撐。