孫亮 周旋 劉桂治 林茂銳 李明友 曹東林

原發(fā)性肝癌是全球男性癌癥死亡的主要原因之一，腸道微生態(tài)是一個包含著大量腸道微生物的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，其可以通過肝-腸循環(huán)參與到肝癌的致病過程中[1-3]。動物研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物菌群紊亂與肝癌關(guān)系密切[4-6]。本研究探索了原發(fā)性肝癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、病例資料

選擇2017年9月至2018年12月廣東省第二人民醫(yī)院診療的原發(fā)性肝癌患者87例，其中男55例，女32例，年齡32～71歲，平均(58.3±8.7)歲。入選標(biāo)準：病理確診為原發(fā)性肝癌患者。排除標(biāo)準：伴發(fā)其他臟器原發(fā)性惡性腫瘤者，曾使用過放化療、生物或者免疫治療者，入組1個月前曾使用過益生菌者，伴發(fā)急慢性胃腸道感染性或免疫異常疾病者。另取健康體檢者80名作為對照，其中男52名，女28名，年齡30～72歲，平均(58.1±8.7)歲。原發(fā)性肝癌與健康對照組在性別和年齡組成方面具有可比性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

二、微生物基因組DNA制備

無菌環(huán)境下收集入組患者中段糞便，使用糞便基因組DNA 快速提取試劑盒(購自北京艾德萊生物科技有限公司)，按照說明書提取總DNA。通用引物擴增16S rDNA V3-V4區(qū)，引物由深圳華大基因設(shè)計合成，引物序列16S rDNA:上游引物 5′-CCTACGG-GAGGCAGCAG -3′，V3-V4區(qū):下游引物 5′-ACGA-GCTGACGACARCCATG -3′。擴增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR試劑盒購自大連寶生物公司，1%瓊脂糖凝膠電泳PCR擴增樣品后，紫外燈下切膠回收PCR擴增產(chǎn)物，使用DNA 凝膠回收試劑盒(美國基因公司產(chǎn)品)純化PCR擴增產(chǎn)物，通過Illumina平臺進行高通量測序(天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司)。

三、測序數(shù)據(jù)分析

將測序數(shù)據(jù)輸入開源微生物種群分析軟件包QIIME，運行工作流pick_de_novo_otus.py腳本程序，作α多樣性分析，然后以 97%以上相似度的標(biāo)準聚類成一類OUT，比對OTU代表序列，對每個OTU進行物種分類，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，總結(jié)OTU信息，總結(jié)分類組成的群落。通過Anosim相似性分析對比原發(fā)性肝癌患者和對照組間微生物菌群的差異。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、原發(fā)性肝癌組和健康對照組間α多樣性

α多樣性中的Chao1 指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和 Gini指數(shù)在原發(fā)性肝癌組和健康對照組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 原發(fā)性肝癌組和健康對照組間α多樣性的比較

二、原發(fā)性肝癌組和健康對照組門水平菌群結(jié)構(gòu)

肝癌組擬桿菌門和變形菌門所占百分比顯著高于健康對照組。肝癌組厚壁菌門和放線菌門所占百分比顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 原發(fā)性肝癌組和健康對照組門水平菌群結(jié)構(gòu)的比較(%，±s)

三、原發(fā)性肝癌組和健康對照組屬水平菌群結(jié)構(gòu)

肝癌組擬桿菌屬和大腸桿菌螺旋桿菌屬所占百分比顯著高于健康對照組(P<0.01)。肝癌組雙歧桿菌屬和梭菌屬所占百分比顯著低于對照組(P<0.01)。見表3。

表3 原發(fā)性肝癌組和健康對照組屬水平菌群結(jié)構(gòu)的比較(%，±s)

討 論

定植于人體胃腸道的細菌參與了各系統(tǒng)器官多種疾病的發(fā)病過程，肝-腸循環(huán)使腸道菌群和肝臟之間聯(lián)系起來[7, 8]。細菌培養(yǎng)是菌群鑒定的主要方法，但目前只有30%的腸道菌群可以培養(yǎng)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步，特別是Illumina 公司推出的 Hi Seq 高通量測序系統(tǒng)為腸道菌群的基因組學(xué)研究提供了方便[9-11]。本研究使用第二代高通量測序技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌組和健康對照組間反應(yīng)α多樣性的Chao1 指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和 Gini指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明了兩組間腸道微生態(tài)的物種多樣性或豐度方面無顯著性差異。

門屬分析顯示，肝癌組擬桿菌門和變形菌門比例顯著高于對照組，而厚壁菌門和放線菌門所占比例顯著低于對照組，以及擬桿菌門中的擬桿菌屬和變形菌門中的大腸桿菌螺旋桿菌屬比例顯著高于對照組，放線菌門中的雙歧桿菌屬和厚壁菌門中的梭菌屬著低于對照組。上述結(jié)果說明了肝癌患者腸道微生物系統(tǒng)中菌群主要以擬桿菌屬和大腸桿菌螺旋桿菌屬為主，擬桿菌屬具有特殊鞘脂結(jié)構(gòu)，代謝中鞘脂失衡可導(dǎo)致細胞周期的紊亂，大腸桿菌螺旋桿菌屬過生長，可抑制雙歧桿菌、乳桿菌等潛在有益菌的生長繁殖[12-17]。本研究結(jié)果顯示，肝癌患者中雙歧桿菌屬比例的降低，梭菌屬中的乳桿菌和腸球菌對機體是有益的，而且有利于黃曲霉毒素的降解[18-20]。調(diào)控這種菌群的失衡是否有利于肝癌的臨床療效改善有待進一步的研究。

綜上所述，肝癌患者腸道微生態(tài)系統(tǒng)中擬桿菌屬以及其隸屬的擬桿菌門，大腸桿菌螺旋桿菌屬以及其隸屬的變形菌門所占比例明顯著高于對照組，雙歧桿菌屬以及其隸屬的放線菌門和梭菌屬以及其隸屬的厚壁菌門所占比例明顯著低于對照組，調(diào)節(jié)這種腸道微生態(tài)系菌落的平衡可能是輔助治療肝癌的新靶點。