張丹雨，陳洋洋，劉曉陽(yáng)，王佳星，張惟材，卜寧，熊向華

1.沈陽(yáng)師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100071；3.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110016；4.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150076

乙醛會(huì)刺激人眼和上呼吸道，可致癌且具有生殖毒性。人體內(nèi)乙醛來(lái)源有2 種，一種是外源性的，如通過呼吸將外源環(huán)境中的乙醛吸入體內(nèi)；另一種是內(nèi)源性的，如通過飲酒或含酒精飲料將乙醇（即酒精）帶入人體，在體內(nèi)經(jīng)乙醇脫氫酶脫氫生成乙醛。人體內(nèi)的乙醛可以被乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）進(jìn)一步代謝。ALDH 是一種氧化還原酶，催化乙醛脫氫生成甲酸，除人體外廣泛存在于動(dòng)植物、微生物中[1]。據(jù)報(bào)道，目前已經(jīng)從自然界中分離出500 多種ALDH[2]，根據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu)、生物活性上的差異可大致分為 ALDH1～ALDH22 共 22 類。其中，主要分布在人體肝、胃、心臟等器官的有19 種，最常見的為 ALDH1～ALDH4[3-5]。在體內(nèi)，ALDH 可催化乙醛轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)害的乙酸，從而使乙醛無(wú)法進(jìn)一步危害機(jī)體。但在大量飲酒的情況下，機(jī)體自身的ALDH 將無(wú)法完全將乙醇代謝產(chǎn)生的乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸，在這種情況下，補(bǔ)充外源ALDH 是一種很好的選擇[6-7]。

目前主要通過機(jī)械或化學(xué)手段從動(dòng)植物體內(nèi)提取ALDH，或?qū)LDH 基因?qū)氪竽c桿菌或畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)純化獲得ALDH[8-9]。提取法ALDH 產(chǎn)量受限，成本較高；而大腸桿菌重組表達(dá)安全系數(shù)低，胞內(nèi)還原環(huán)境使二硫鍵形成受阻，重組蛋白無(wú)法正確折疊，易形成包涵體蛋白；畢赤酵母表達(dá)則需要甲醇誘導(dǎo)，但甲醇有毒且易燃易爆，對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)物的安全性會(huì)有一定的影響[10]。

乳酸乳球菌是公認(rèn)的食品級(jí)安全微生物，宿主菌自身及表達(dá)系統(tǒng)的選擇標(biāo)記和誘導(dǎo)物均為食品級(jí)，乳酸乳球菌制品可直接口服，異源表達(dá)產(chǎn)物的安全性有保障[11]。我們通過乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了畢赤酵母的ALDH，在低pH 條件下依然具有活性，可耐受人體胃酸環(huán)境，為研發(fā)口服解酒制劑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

乳酸乳球菌NZ9000、質(zhì)粒pNZ8048 由軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所王艷春副研究員惠贈(zèng)；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞MC1061（按大腸桿菌超級(jí)感受態(tài)的制備試劑盒制備）購(gòu)自上海生工公司；引物、ALDH 基因由北京擎科生物科技有限公司合成；重組試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京達(dá)科為生物科技有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自ThermoFish?er Scientific 公 司 ；His 抗 體 購(gòu) 自 AbMART 公 司 ；Western 印跡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ni 柱購(gòu)自GE 公司。

1.2 ALDH表達(dá)載體構(gòu)建

由北京擎科生物科技有限公司合成ALDH 基因（GenBank 序列號(hào) GQ397253.1），設(shè)計(jì)同源重組上下游引物（上游引物為5′-CATGGGTACTGCAG?GCATGCTTAGAACTGCAACTAGAACTACTTTC-3′，下游引物為5′-GAAAGCTTGAGCTCTCTAGATTA GTGGTGGTGGTGGTGGTGTTGTGGGCCATCGTTAA TGG-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃ 30 s，退火 55℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；終延伸 72℃ 10 min），PCR 產(chǎn)物與NcoⅠ/XbaⅠ雙酶切的pNZ8048 質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收產(chǎn)物經(jīng)同源重組后轉(zhuǎn)入大腸桿菌MC1061 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB（含10 μg/mL 氯霉素）平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落至LB（含10 μg/mL 氯霉素）液體中，37℃、200 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，經(jīng)菌液PCR 和質(zhì)粒NcoⅠ/XbaⅠ雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆送測(cè)序。

1.3 ALDH的誘導(dǎo)表達(dá)

將 1 μL 重組質(zhì)粒 pNZ8048-ALDH 電轉(zhuǎn)（20 V，25 μF，200 Ω）至 50 μL 乳酸乳球菌 NZ9000感態(tài)中，30℃孵育 1 h 后涂布于 GM17（含 10 μg/mL 氯霉素）平板，30℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落于GM17（含10 μg/mL 氯霉素）液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；將過夜培養(yǎng)的菌液以1% 的體積比接種至GM17（含10 μg/mL 氯霉素）液體培養(yǎng)基，30℃靜置培養(yǎng)至D600nm約為1.0，加入Nisin 誘導(dǎo)劑至終濃度為10 μg/mL，30℃靜置誘導(dǎo)4 h；取誘導(dǎo)后的菌液 1 mL 于 EP 管中，12 000 r/min 離心 2 min，棄上清，加入500 μL TE 緩沖液，超聲波破碎，取全菌裂解液、裂解液上清及裂解液沉淀，進(jìn)行10%的SDS-PAGE，經(jīng)凝膠掃描后分析蛋白表達(dá)水平及表達(dá)形式。

摸索不同濃度的誘導(dǎo)劑及不同誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響。在30℃和37℃條件下分別設(shè)置4 種誘導(dǎo)劑濃度，即0.5、1、1.5、2.0 μg/mL，進(jìn)行SDS-PAGE。在30℃條件下，待菌液D600nm約為1.0時(shí)加入Nisin 誘導(dǎo)劑至終濃度10 μg/mL，分別誘導(dǎo) 0、2、4、6、8 h，進(jìn)行 SDS-PAGE。觀察蛋白表達(dá)情況，找到最佳誘導(dǎo)條件。

1.4 ALDH活性檢測(cè)

據(jù)文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道，ALDH 以 NAD+、NADH 為輔酶，還原性的NADH 在340 nm 處有最大吸收峰。酶、輔酶NAD+和底物在一定條件下可以反應(yīng)，通過測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)D340nm值的變化，就可以得到NADH 生成量，從而計(jì)算酶活。取誘導(dǎo)后1 mL 菌液，離心收集菌體，加入500 μL TE 緩沖液，超聲波破碎后獲得粗酶液；以pNZ8048/NZ9000 為陰性對(duì)照。酶活測(cè)定體系見表1。配制反應(yīng)體系后，在35℃金屬浴中預(yù)熱10 min，加入酶液，立即混勻，迅速倒入比色皿中，測(cè)定D340nm值。最適條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol 底物定義為1 個(gè)活力（U），反應(yīng)體系里ALDH 的酶活計(jì)算公式為：

按照酶活測(cè)定體系測(cè)定菌裂解液的酶活，總反應(yīng)體系3 mL，加入100 μL 酶液后迅速測(cè)定每分鐘的D340nm值。取反應(yīng)時(shí)間5～10 min 的變化值，計(jì)算每分鐘內(nèi)D340nm的變化值。

1.5 ALDH的純化

將活化的菌液以1% 的接種量接種至200mL GM17 培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)后收集菌體，6000 r/min 離心 20 min，用 Tris-HCl（終濃度 50 mmol/L）重懸菌體，超聲波破碎菌體；菌裂解液于4℃、8000 r/min 離心 10 min 沉降菌體，棄菌體，將上清過0.45 μm 濾膜，用預(yù)裝Ni 柱純化。經(jīng)結(jié)合緩沖液（7.2 mmol/L Na2HPO4·12H2O，12.9 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑 ，pH7.4）結(jié)合，收集穿過液；經(jīng)洗脫液（7.2 mmol/L Na2HPO4·12H2O，12.9 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH7.4）梯度洗脫，收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE。

表1 酶活測(cè)定反應(yīng)體系

2 結(jié)果

2.1 pNZ8048-ALDH表達(dá)載體構(gòu)建

合成基因片段與pNZ8048 重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR 鑒定，瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶與陽(yáng)性對(duì)照相同（圖1A）。將陽(yáng)性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行NcoⅠ/XbaⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖1B，目的片段大小與預(yù)期一致。將陽(yáng)性克隆送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的序列進(jìn)行DNAMAN比對(duì)，顯示基因序列一致（圖2），說明pNZ8048-ALDH 質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 ALDH的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建的pNZ8048-ALDH 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至乳酸乳球菌NZ9000，以最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)后收集菌體，超聲波破碎后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示有與預(yù)期目的蛋白大小相符的特異性表達(dá)條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約為57×103，目的條帶約占全菌蛋白的17.16%（圖3A）；取上清與沉淀分別進(jìn)行SDSPAGE，結(jié)果表明目的蛋白為半可溶性表達(dá)半包涵體表達(dá)（圖3B）；以His 抗體為一抗，Western 印跡結(jié)果（圖3C）表明目的蛋白與His 抗體有特異性結(jié)合。綜上，ALDH 在乳酸乳球菌NZ9000 中獲得表達(dá)。

圖1 pNZ8048-ALDH 重組載體的菌液PCR（A）及雙酶切鑒定（B）

誘導(dǎo)條件摸索結(jié)果如圖4A 所示，在30℃和37℃培養(yǎng)條件下，隨著誘導(dǎo)劑終濃度的提高，目的蛋白表達(dá)量逐漸增加，誘導(dǎo)劑終濃度為1 μg/mL時(shí)表達(dá)量最高，30℃時(shí)目的蛋白的表達(dá)量?jī)?yōu)于37℃。最終確定 30℃、1 μg/mL Nisin 誘導(dǎo) 4 h 為ALDH 的最佳表達(dá)條件（圖4B）。

2.3 ALDH的純化

菌裂解液通過親和Ni 柱層析純化，收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖5，純化樣品與對(duì)照樣品有相同大小的蛋白條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約為57×103，與預(yù)期相符。

3 討論

圖2 pNZ8048-ALDH 重組載體的DNAMAN 比對(duì)結(jié)果

圖3 pNZ8048-ALDH 全菌蛋白的SDS-PAGE（A）、表達(dá)形式（B）及Western 印跡（C）

圖4 誘導(dǎo)劑濃度（A）及誘導(dǎo)時(shí)間（B）對(duì)ALDH 表達(dá)的影響

圖5 His 純化后的蛋白樣品

獲得ALDH 的主要方式有通過機(jī)械手段和化學(xué)手段從動(dòng)物肝臟或植物組織中提取的提取法，以大腸桿菌和畢赤酵母作為宿主表達(dá)目的蛋白的表達(dá)法。提取法所得目的蛋白產(chǎn)量有限。黃娟等[13]采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得包涵體表達(dá)的ALDH，復(fù)性時(shí)不可避免地導(dǎo)致蛋白損失或結(jié)構(gòu)改變。本研究將ALDH 通過重組整合到pNZ8048質(zhì)粒上，以食品級(jí)乳酸乳球菌NZ9000 為宿主菌表達(dá)目的蛋白，表達(dá)量占全菌蛋白的17.163%，其中可溶性表達(dá)占53%，表明乳球菌表達(dá)較大腸桿菌包涵體表達(dá)有優(yōu)勢(shì)。另外，無(wú)論經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)還是經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的ALDH 其安全性皆有待考證，而本研究經(jīng)食品級(jí)Nisin 誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)乳酸乳球菌表達(dá)的蛋白安全系數(shù)更高。在目前表達(dá)水平基礎(chǔ)上，還可以通過優(yōu)化誘導(dǎo)起始菌密度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度及時(shí)間來(lái)進(jìn)一步提高ALDH 的表達(dá)量和可溶性表達(dá)比例。

黃娟等利用大腸桿菌所表達(dá)的ALDH 活性為1.449 U/mL，本研究利用乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的ALDH 活性為0.638 U/mL，從酶活水平來(lái)看，乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)所獲得的蛋白酶活相較于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)略低，還須通過優(yōu)化條件來(lái)提高酶的活性，從而獲得高活性的蛋白。

目前ALDH 多用于乙醛代謝檢測(cè)、降解石油烷烴，以及化妝品、化工、環(huán)境保護(hù)等方面。本研究以乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ALDH，表達(dá)水平高，生產(chǎn)成本低，方法簡(jiǎn)易，具有較大的研究意義與實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。