李華月，劉婕，韓洋，丁麗華，葉棋濃

1.貴州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100850；3.陸軍第81集團軍醫(yī)院，河北 張家口 075000

腫瘤是在多種致癌因子的作用下，由于基因突變，導(dǎo)致細胞增殖失控而發(fā)生的，其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[1]在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移方面起到了至關(guān)重要的作用。EMT 是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程，在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病中發(fā)揮重要作用，其主要的特征有細胞黏附分子（如E-鈣黏蛋白）表達的減少、細胞角蛋白細胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白為主的細胞骨架及形態(tài)上具有間充質(zhì)細胞的特征等[2]。Slug 是轉(zhuǎn)錄因子Snail 家族中的鋅指蛋白。最初發(fā)現(xiàn)，Slug 在背部神經(jīng)管表達，參與神經(jīng)胚的形成與神經(jīng)干的正常發(fā)育，在EMT 過程中扮演重要角色[3]。Slug 有高度保守的C2H2 型鋅指結(jié)構(gòu)域，可以通過與E-box 結(jié)構(gòu)域結(jié)合而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄[4]。我們從乳腺cDNA 文庫中克隆了Slug 的全長編碼序列，構(gòu)建了Slug 慢病毒真核表達載體，嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定表達Slug 的ZR75-1 細胞，為進一步檢測Slug 在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中對EMT 的影響以及作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

ZR75-1 乳腺癌細胞、人胚腎293T 細胞、大腸桿菌DH5 和慢病毒pCDH 載體由本實驗室保存；DMEM 及小牛血清購于Gibco 公司；轉(zhuǎn)染試劑VigoFect 為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Megatran 為 Origene 公司產(chǎn)品；LATaq酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ購自Ta?KaRa 公司；Slug、GAPDH 等抗體購自 Abcam 公司；質(zhì)粒提取、膠回收和PCR 回收試劑盒均為Pro?mega 公司產(chǎn)品；上下游引物由北京賽百盛公司合成；測序由北京博邁得生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 pCDH-Slug慢病毒表達載體的構(gòu)建

以乳腺文庫為模板，用上游引物（5′-CGGAA TTCGCCACCATGCCGCGCTCCTTCCTG-3′）和 下 游引物（5′-CGGGATCCGTGTGCTACACAGCAGCCA-3′）擴增 Slug 編碼基因，采用 1×TaqPCR Mix 酶（反應(yīng)條件：98℃變性3 min，然后以94℃變性10 s、58℃退火 15 s、72℃延伸 1 min 進行 29 個循環(huán)，72℃再延伸4 min）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)目的條帶大小回收擴增的DNA 片段。用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切回收的PCR 產(chǎn)物和pCDH表達載體，用膠回收試劑盒回收酶切目的基因和pCDH 載體，使載體和PCR 產(chǎn)物有相同的黏性末端，后用T4DNA 連接酶常溫連接4 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂板，培養(yǎng)16～20 h 后挑選陽性克隆，菌液 PCR 鑒定，測序。

1.3 穩(wěn)定克隆篩選

將293T 細胞接種于6 孔板，接種密度為60%～70%，轉(zhuǎn)染時，將包裝質(zhì)粒VSVG、PAX2 分別與構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCDH-Slug 和空載體質(zhì)粒pCDH 混勻于200 μL 無血清無雙抗的DMEM 中，分別加入 27 μL Megatran 轉(zhuǎn)染試劑，振蕩 10 s 混勻，室溫靜置10 min 后加入孔中，48 h 后收取病毒液上清，3000 r/min 離心5 min。將包裝好的病毒上清加入接種好的ZR75-1 細胞中，6 cm 皿加入4 mL病毒液，24 h 后換液，感染48 h 后每孔加入嘌呤霉素（2 μg/mL），細胞死亡較多時換液，并繼續(xù)提高嘌呤霉素含量進行篩選，待細胞數(shù)量不再減少時即可得到穩(wěn)定的混合克隆。

1.4 Western印跡檢測

收集穩(wěn)定表達Slug 的ZR75-1 細胞和空載體細胞，用 1×PBS 洗滌 2 次，離心后去上清，加蛋白裂解液（RIPA）冰浴30 min，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸15 min 使蛋白變性，12 000 r/min 離心10 min，取上清液進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶常溫封閉1～2 h，加入 Slug 抗體（1∶200）、E-鈣黏蛋白抗體（1∶200）和 GAPDH 抗體（1∶3000），均 4℃孵育過夜，1×TBST 洗膜 3 次，每次 5 min，加入 1∶3000 稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG 抗體，室溫孵育 1 h，1×TBST 洗膜 3 次，每次 5 min，化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.5 免疫熒光檢測

將穩(wěn)定表達Slug 的ZR75-1 細胞和空載體細胞接種于24 孔板，接種前在24 孔板內(nèi)放入載玻片，待細胞密度達到40%左右時，移除培養(yǎng)液，用1×PBS 洗 2 次，加入冰甲醇固定 5 min，1×PBS 于搖床洗 3 次，每次 10 min；0.5% Triton-100 溶于 1%的羊血清于冰上放置10 min；1%的羊血清封閉30 min；將玻片細胞面向下倒扣到1%羊血清稀釋的E-鈣黏蛋白（1∶200）抗體，于濕盒中避光孵育4 h；用1%羊血清洗3 次，每次10 min；加入1%羊血清稀釋的 FITC 抗體（1∶1000），室溫避光放置 2 h；用 1×PBS 洗 3 次，每次 10 min；DAPI 染色 5 min，1×PBS 洗 2 次，每次 5 min；加 15 μL 防淬滅劑后封片拍照。

1.6 劃痕實驗

將穩(wěn)定表達Slug 的ZR75-1 細胞和空載體細胞接種于 6 孔板，每孔細胞數(shù)約為 5×105，1 d 后用槍頭在六孔板中垂直劃下，PBS 洗3 次，加入無血清培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于 0、24 h 拍照，記錄細胞遷移的位置，用圖像軟件測量細胞的遷移距離。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增Slug基因

以乳腺文庫為模板，PCR 擴增Slug 全長編碼序列，獲得長度為 750～1000 bp 的 DNA 片段，大小與預(yù)期一致（圖1）。

2.2 pCDH-Slug表達載體的構(gòu)建

PCR 擴增的Slug 編碼序列和pCDH 載體分別用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，抗性篩選得到重組質(zhì)粒，菌液PCR 鑒定為陽性（未顯示）者用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切，在750～1000 bp 位置可見特異片段，而空載體無此特異條帶（圖2）。結(jié)果表明pCDH-Slug 真核表達載體構(gòu)建成功。

2.3 pCDH-Slug在293T細胞內(nèi)的表達鑒定

將上述陽性克隆提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染293T 細胞，對照組轉(zhuǎn)染 pCDH 空載體，24 h 后收細胞，West?ern 印跡檢測細胞內(nèi)Slug 的表達，以GAPDH 為內(nèi)參。結(jié)果見圖3，在相對分子質(zhì)量32×103處，轉(zhuǎn)染pCDH-Slug 真核表達載體的細胞組明顯可見特異性條帶，對照組則條帶微弱，與預(yù)期結(jié)果相符，pCDH-Slug 表達載體在293T 細胞中獲得表達。

2.4 Slug對ZR75-1乳腺癌細胞形態(tài)的影響

圖1 PCR 擴增 Slug 基因

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

圖3 pCDH-Slug 在293T 細胞中的表達鑒定

如果上皮細胞發(fā)生EMT，細胞形態(tài)會改變。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達pCDH 的ZR75-1 乳腺癌細胞形態(tài)未改變，而穩(wěn)定表達Slug 的乳腺癌細胞形態(tài)變?yōu)樗笮裕▓D4）。結(jié)果說明Slug 可以促進ZR75-1 乳腺癌細胞形態(tài)發(fā)生改變，發(fā)生EMT 化。

2.5 Slug對E-鈣黏蛋白表達的影響

將經(jīng)過嘌呤霉素篩選的穩(wěn)定表達pCDH 或pCDH-Slug 的ZR75-1 乳腺癌細胞株分別接種于6 cm 皿，待細胞密度為80%～90%時收集細胞，分別用Western 印跡和免疫熒光檢測Slug 對E-鈣黏蛋白的影響（圖5）。Western 印跡顯示，與對照組相比，穩(wěn)定表達Slug 的ZR75-1 乳腺癌細胞中E-鈣黏蛋白表達水平明顯下降；免疫熒光檢測結(jié)果與Western 印跡結(jié)果一致。結(jié)果表明Slug 可以抑制E-鈣黏蛋白的表達。

圖4 Slug 對ZR75-1 乳腺癌細胞形態(tài)的影響

圖5 Slug 對E-鈣黏蛋白表達的影響

2.6 Slug對ZR75-1乳腺癌細胞遷移的影響

將穩(wěn)定表達pCDH 或pPCDH-Slug 的ZR75-1乳腺癌細胞接種于六孔板，劃痕24 h 后計算細胞遷移距離。結(jié)果見圖6，Slug 高表達組ZR75-1 細胞的遷移距離明顯大于空載體對照組。以上均為3 次獨立實驗結(jié)果的平均值，結(jié)果表明Slug 可以促進ZR75-1 乳腺癌細胞遷移。

3 討論

圖6 Slug 對ZR-751 乳腺癌細胞遷移的影響

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟的過程。EMT 是上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，以上皮細胞極性的喪失和間質(zhì)特性的獲得為主要特征[5]，與腫瘤關(guān)系密切。E-鈣黏蛋白的減少或丟失是EMT 最重要的標(biāo)志性變化[6]。Slug 是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的EMT 轉(zhuǎn)錄因子，通過與E-box結(jié)構(gòu)域結(jié)合而抑制E-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。E-鈣黏蛋白廣泛分布于胚胎組織和成熟組織的上皮細胞中，除具有調(diào)節(jié)胚胎組織的發(fā)育、組織形成、參與細胞與細胞間信息傳遞交流等作用外，對促進細胞的黏附聚集、維持上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性、維持細胞極性和參與分化調(diào)節(jié)也至關(guān)重要[8]。我們構(gòu)建了Slug 慢病毒表達載體pCDH-Slug，發(fā)現(xiàn) Slug 可以促使 ZR-751 乳腺癌細胞形態(tài)發(fā)生改變，還可以降低E-鈣黏蛋白的表達。E-鈣黏蛋白作為細胞黏附分子家族中的一員，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤密切相關(guān)[7]。因此，我們推斷Slug 可能通過調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白的表達，從而影響乳腺癌細胞的浸潤、遷移。本研究為進一步探討Slug 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制開辟了新的方向，也為臨床分子靶向治療奠定了基礎(chǔ)。