吳鈺彬，李姝璇，侯汪衡，楊宏偉，趙歡，吳林麗，吳文偉，朱峻毅，張軍，程通

1.廈門大學 生命科學學院 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，福建 廈門 361102；2.廈門大學 公共衛(wèi)生學院，福建 廈門 361102

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）是一種可通過蟲媒、母嬰等途徑傳播的病毒[1-3]。ZIKV 感染可引起發(fā)熱、結膜炎、皮疹、關節(jié)痛等非特異性癥狀，也可導致嬰幼兒小頭癥和成人格林-巴利綜合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）等疾病[4-6]。近年來，ZIKV 在世界范圍內多次暴發(fā)流行，截至2017年底，全球已有84 個國家和地區(qū)報告寨卡病毒病疫情，ZIKV 感染已成為當今國際公共衛(wèi)生面臨的重大問題之一[7]。

ZIKV 為單股正鏈RNA 病毒，其基因組可編碼3 種結構蛋白（衣殼蛋白C、前體膜結合蛋白prM 與包膜蛋白 E）和 7 種非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）[8-9]。其中，非結構蛋白的功能主要與病毒基因組的復制、轉錄及調節(jié)宿主細胞免疫應答有關[10-12]。ZIKV NS2B 蛋白由130 個氨基酸殘基構成，相對分子質量（Mr）約為15×103，在病毒復制、組裝及致病過程中具有重要作用[13-15]。研究顯示，ZIKV NS2B 蛋白可與NS3 蛋白的N 端區(qū)域結合形成蛋白酶復合物，并剪切 C/prM、NS2A/2B、NS2B/NS3、NS3/NS4A及NS4B/NS5 等病毒前體蛋白[8]。抑制NS2B 與NS3 的相互作用及蛋白酶復合物的形成有望有效抑制病毒感染，是發(fā)展ZIKV 蛋白酶類抑制劑和新型抗病毒藥物的一個重要方向[16-17]。目前，關于NS2B 在ZIKV 生活史及病毒與宿主細胞相互作用過程中的詳細機制仍有待深入研究，加強NS2B蛋白相關研究也將有助于發(fā)展新型抗病毒藥物。特異性單克隆抗體是支持蛋白功能研究的重要工具，目前尚缺乏針對NS2B 蛋白的單克隆抗體，篩選獲得具有較好反應性能的特異性單克隆抗體，對支持開展相關研究具有重要意義。

我們采用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達獲得重組NS2B 蛋白，經免疫、融合篩選，獲得了具有良好反應性的抗NS2B 單克隆抗體，并通過Western 印跡和免疫熒光等方法驗證了該抗體可用于ZIKV NS2B 蛋白的免疫檢測。本研究結果可為開展ZIKV NS2B 相關研究提供支持。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF 級 BALB/c 小鼠、SPF 級 F1 小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0，人胚胎腎細胞HEK-293T，非洲綠猴腎細胞Ve?ro，大腸桿菌 DH5α、ER2566 感受態(tài)細胞，原核表達載體質粒pGEX-6P-1 由本實驗室保存；ZIKV非洲型毒株 MR766（ATCC VR1838，GenBank No.LC002520）、ZIKV 亞洲型毒株 PRVABC59（ATCC VR1843，GenBank No.KU501215）均 購 自 ATCC；ZIKV NS2B 全長基因序列Asian-NS2B（參考序列為GenBank No.KU365779）由上海生工公司合成，克隆至載體pUC57；可表達攜帶有Flag 標簽的NS2B 蛋白的哺乳細胞表達載體質粒pcDNA3-flagNS2B 由 美 國 Howard 大 學 醫(yī) 學 院 Tang Qiyi 教授饋贈[18]。

限制性核酸內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、DNA 相對分子質量標準、預染蛋白相對分子質量標準均購自TaKaRa 公司；微量膠回收及質粒小提取試劑盒購自 TianGen 公司；Gibson Assembly Master Mix購自 NEB 公司；Western 印跡顯色試劑 Super Sig?nal West Femto Maximum Sensitivity Substrate 試劑盒購自Thermo Scientific 公司；轉染試劑Lipo?fectAMINE 3000 Transfection Reagent、BCA 蛋 白濃度測定試劑盒、RIPA 裂解液（強）、Alexa Fluor 647 羊抗兔 IgG 購自碧云天公司；Anti-His 鼠抗購自北京全式金公司；Alexa Fluor 488 羊抗鼠IgG、RPMI 1640 購自 Invitrogen 公司；DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco 公司；Anti-flag 兔抗購自Cell Signaling Technology 公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、多聚甲醛購自Sigma 公司；胎牛血清購自Ce?grogen 公司；RNAED 酶稀液購自北京萬泰公司；菌 體 裂 解 液（20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH7.2）由實驗室配制。

1.2 重組質粒pGEX-6P-1-NS2B的構建與鑒定

以Asian-NS2B 基因為模板，在NS2B 基因的兩端設計引物 ZIKV-NS2B-F（5′-GGGCCCCTGGG ATCCCCGGAATTCATGAGCTGGCCTCCTAGCGAAG-3′，下劃線序列為EcoRⅠ酶切位點）和ZIKVNS2B- R（5′- TCAGTCACGATGCGGCCGCTCGAGT TAATGATGATGATGATGGTGCCTTTTTCCAGTCTTC AC-3′，下劃線序列為XhoⅠ酶切位點），通過PCR擴增，在蛋白C 端插入一段6×His 標簽，切膠回收獲得目的片段。將回收得到的片段與經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的載體pGEX-6P-1 連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落提取質粒并經雙酶切驗證，將驗證正確的克隆送上海生工公司測序鑒定。

1.3 ZIKV NS2B重組蛋白的表達與純化

將測序正確的重組質粒pGEX-6P-1-NS2B 轉化大腸桿菌ER2566 表達菌株，挑取單菌落接種至5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌液D600nm值為 0.6～0.8 時，加入終濃度為 5 μmol/L 的 IPTG，24℃誘導重組蛋白的表達。誘導結束后，離心收集菌體，超聲波破碎，同時收集離心上清和沉淀，用10%的SDS-PAGE 鑒定重組蛋白的表達方式。采用Ni2+親和層析從菌體上清中純化帶有His 標簽的rGST-NS2B 蛋白；采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定純化獲得的重組蛋白濃度；采用SDSPAGE 進行蛋白鑒定。

1.4 單克隆抗體的制備與純化

純化后的重組蛋白與弗氏佐劑等體積混合至乳化狀態(tài)，以皮下多點注射的方式免疫6 周齡BALB/c 雌鼠，免疫劑量為 100 μg/只，共免疫 3針，每次間隔2 周，每次免疫前1 d 對小鼠進行下眼眶靜脈采血。細胞融合前3 d 對小鼠脾臟進行加強免疫，劑量為50 μg/只。脾臟加強免疫3 d后，取小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0 進行融合。融合后的細胞在培養(yǎng)的第5 d 進行換液，第7 d 取細胞上清分別進行包被重組蛋白rGST-NS2B、rGST-NS3 的 間 接 ELISA 檢 測 ，對rGST-NS3 的間接ELISA 檢測是用于扣除GST 蛋白免疫原性的影響。對rGST-NS2B 檢測結果為單獨陽性的細胞孔進行多輪克隆化，直至獲得能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的融合細胞株，取細胞上清對抗體的亞型進行鑒定。在F1 小鼠腹腔注射融合細胞株懸液，收集腹水，通過辛酸-飽和硫氨沉淀和Protein-A 親和層析柱純化腹水，獲得純化后的單克隆抗體。

1.5 抗體效價測定

將純化的重組蛋白rGST-NS2B 進行ELISA 包被，采用碳酸鹽緩沖液將rGST-NS2B 稀釋至1 μg/mL，按每孔 100 μL 加至 96 孔板，37℃包被 4 h。用 PBST 洗板 1 次，用含 3% BSA 的 PBS 于 37℃封閉2 h。以不同稀釋比例的單克隆抗體作為一抗（起始濃度為1 mg/mL，從1∶10 稀釋比開始梯度稀釋至1∶10 000 000），每孔100 μL，37℃孵育1 h；用 PBST 清洗 5 次，加入 100 μL 標有辣根過氧化物酶（HRP）的羊抗鼠（Goat anti-Mouse，GAM）抗體作為二抗，37℃孵育30 min；用PBST清洗 5 次，每孔加入 100 μL TMB 顯色液，37℃孵育 15 min；最后加入 50 μL 終止液（2 mol/L 硫酸），用酶標儀讀取D450nm值?？贵w的效價為判定為陽性時的抗體最大稀釋比。實驗樣品孔以P/N值［（樣品D450nm值-空白對照D450nm值）/（陰性對照D450nm值-空白對照D450nm值）］≥2 時判定為陽性，陰性對照為無關抗體檢測孔。

1.6 Western印跡

收集感染與未感染ZIKV MR766 毒株、PRV?ABC59 毒株 48 h 后的 Vero 細胞，以及轉染真核表達質粒pcDNA3-flagNS2B 和pcDNA3 空載質粒48 h 后的 HEK-293T 細胞，用含有 1 mol/L PMSF 的RIPA（強）裂解液冰上裂解細胞5 min，加入6×上樣緩沖液，沸水浴10 min 后進行12% SDSPAGE。電泳結束后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用BSA 室溫封閉1 h，以純化獲得的NS2B單克隆抗體2H11 作為一抗（濃度1 μg/mL），37℃孵育 1 h；以 HRP 標記的 GAM 抗體為二抗，37℃孵育40 min；最后采用Super Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrate 試劑盒進行顯色并拍照觀察。

1.7 免疫熒光檢測

在24 孔細胞培養(yǎng)板中放入潔凈的蓋玻片，接種Vero 或 HEK-293T 細胞（約 5×103/孔）。在感染與未感染ZIKV MR766 毒株、PRVABC59 毒株48 h 后的Vero 細胞和轉染空載體pcDNA3 及真核表達質粒 pcDNA3-flagNS2B 的 HEK-293T 細胞中，依次加入預冷的4%多聚甲醛和含0.1% Triton X-100 的 PBS 進行 10 min 細胞固定和 15 min 細胞通透；采用20%山羊血清封閉20 min；以2H11 單克隆抗體或Anti-flag 單克隆抗體為一抗，用NRAED酶稀液將抗體稀釋至10 μg/mL，37℃孵育1 h；以Alexa Fluor 488 標記的GAM 抗體或Alexa Fluor 647 標記的山羊抗兔 IgG（Goat anti-Rabbit，GAR）抗體為二抗，37℃避光孵育30 min，用DAPI 進行細胞核染色5 min，最后加入封片劑，晾干后用熒光顯微鏡進行圖像觀察和采集。

2 結果

2.1 ZIKV NS2B重組蛋白的表達、純化與鑒定

將測序正確的NS2B 重組蛋白表達質粒pGEX-6P-1-NS2B 轉化大腸桿菌ER2566 并誘導表達，采用SDS-PAGE 分析重組蛋白表達情況。結果顯示，與未誘導組相比，IPTG 誘導組在預期的Mr約 42×103位置（重組 NS2B 蛋白的 N 端和 C 端分別帶有GST 標簽和His 標簽，單獨NS2B 蛋白的Mr約 15×103，GST 標簽蛋白約 27×103）有明顯的重組蛋白表達條帶（圖1A）。對誘導組菌體細胞進行超聲波破碎處理后分析顯示，NS2B 重組蛋白以可溶形式表達（圖1B）。將菌體超聲波破碎后獲得的離心上清應用Ni2+柱親和層析法對目標蛋白進行純化，采用250 mmol/L 咪唑洗脫蛋白，將穿透樣品和洗脫樣品分別進行SDS-PAGE 分析。結果顯示，洗脫液中在預期42×103位置可獲得較高純度的重組蛋白。進一步應用抗His 抗體進行Western 印跡檢測（圖1C），該主要蛋白條帶為預期目標蛋白，可用于后續(xù)免疫和抗體制備研究。

2.2 ZIKV NS2B單克隆抗體的制備及性質鑒定

將獲得的重組NS2B 蛋白免疫BALB/c 小鼠，應用雜交瘤技術、ELISA 檢測篩選和細胞株克隆化篩選，獲得1 株能夠穩(wěn)定分泌抗ZIKV NS2B 單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為2H11。應用單克隆抗體小鼠腹水制備方法制備并純化獲得了單克隆抗體2H11（圖2A）。應用小鼠抗體分型試劑盒對單抗2H11 的亞型進行鑒定，結果顯示2H11 為IgG1 亞型。為了驗證2H11 是否可用于NS2B 蛋白的免疫檢測，應用單抗2H11 對ZIKV NS2B 真核表達質粒pcDNA3-flagNS2B 和對照質粒pcDNA3 分別轉染 48 h 后的 HEK-293T 細胞進行Western 印跡和免疫熒光檢測。Western 印跡結果顯示，2H11 與轉染pcDNA3-flagNS2B 質粒的細胞裂解樣品具有特異反應，反應條帶相對分子質量約為15×103，與NS2B 蛋白的理論大小基本一致，且該抗體與轉染pcDNA3 的細胞裂解樣品無明顯反應（圖2B）。免疫熒光檢測結果顯示（圖2C），2H11 可與轉染pcDNA3-flagNS2B 質粒后的HEK-293T 細胞產生特異免疫熒光反應，由于pcDNA3-flagNS2B 質粒表達的 NS2B 蛋白攜帶 Flag 標簽，本研究也同時應用Anti-Flag 兔抗對轉染后細胞進行免疫熒光檢測，結果顯示，NS2B 單抗2H11 反應產生的綠色熒光信號與Anti-Flag 兔抗反應產生的紅色熒光信號在pcDNA3-flagNS2B 轉染后細胞的胞質中為共定位，而在未進行質粒轉染或轉染對照質粒pcDNA3 的細胞中均無特異性反應。上述結果說明，本研究構建的單抗2H11 可用于細胞中表達的NS2B 抗原的免疫檢測。

2.3 抗體2H11對ZIKV感染細胞中NS2B蛋白的檢測

圖1 寨卡病毒NS2B 重組蛋白的表達純化與Western 印跡鑒定

本研究進一步分析了單抗2H11 是否可用于檢測ZIKV 感染后細胞中的NS2B 抗原。分別對感染與未感染ZIKV 亞洲型代表性毒株PRVABC59毒株或非洲型代表性毒株MR766 的Vero 細胞進行Western 印跡和免疫熒光檢測。Western 印跡結果顯示（圖3A），抗體2H11 可與感染PRVABC59毒株或MR766 毒株的細胞裂解樣品特異反應，反應條帶大小約為15×103，與NS2B 蛋白的理論大小相符，而與未被病毒感染的Vero 細胞裂解樣品無特異性反應。免疫熒光檢測結果顯示（圖3B），2H11 與 PRVABC59 毒 株或 MR766 毒株感 染 后的Vero 細胞均有特異性反應，與未感染病毒的對照Vero 細胞無反應。上述結果說明，本研究構建的單克隆抗體2H11 可用于ZIKV 感染后細胞中的NS2B 抗原的免疫檢測。

3 討論

ZIKV 的感染與腦膜炎、急性睪丸炎、急性播散性腦脊髓炎、呼吸窘迫綜合征、心力衰竭和嚴重血小板減少癥等多種疾病有關，目前尚無針對ZIKV 的特效藥和疫苗上市[19-22]。制備可靶向病毒重要蛋白的單克隆抗體，有助于為ZIKV 蛋白功能研究及抗病毒藥物研究提供支持。

圖2 抗體純化及鑒定Western 印跡檢測NS2B 重組蛋白

圖3 NS2B 蛋白在感染不同亞型ZIKV 毒株的Vero 細胞中的表達

NS2B 是ZIKV 的重要非結構蛋白，可以激活NS3 蛋白并形成NS2B-NS3 蛋白酶復合物，該復合物具有剪切病毒前體蛋白功能，對蛋白質的加工成熟和病毒的復制、致病具有重要作用[8,14-15]。研究顯示，在病毒感染過程中，NS2B-NS3 蛋白酶復合物可通過大量消耗宿主細胞的自噬相關蛋白ATG16L1 和真核翻譯起始因子eIF4G1 來協(xié)助病毒逃避宿主的免疫系統(tǒng)，并促進自身復制[23]。目前，關于NS2B 蛋白在宿主細胞內的發(fā)展過程及ZIKV 感染、復制等問題仍有待進一步闡釋。由于NS2B 及相關病毒抗原在ZIKV 感染中的重要作用，以NS2B-NS3 蛋白酶復合物為靶點，抑制NS2B-NS3 蛋白酶復合物的形成是目前開展新型抗病毒藥物研究的重要方向。已有研究篩選獲得了3 種具有抑制ZIKV 感染功能的化合物替莫卟酚、氯硝柳胺和硝唑尼特，其中的替莫卟酚可通過結合NS2B 關鍵殘基和NS3 的“口袋區(qū)”發(fā)揮抗病毒作用，該化合物不僅可以抑制人胎盤和神經祖細胞中的ZIKV 復制，還可以減少小鼠模型中由ZIKV 感染導致的病毒血癥和小鼠死亡[16]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，小分子抑制劑5-amino-1-（（4-methoxyphenyl）sulfonyl）-1H-pyrazol-3-yl benzoate也可與NS2B-NS3 蛋白酶復合體共價結合，使該復合體產生緊湊的閉合構象，從而無法發(fā)揮蛋白水解酶功能[24]。本研究構建的靶向NS2B 蛋白的單克隆抗體2H11 可為相關研究提供重要支持。

本研究采用原核細胞表達純化的重組NS2B蛋白作為免疫原，制備獲得靶向ZIKV NS2B 蛋白的單克隆抗體。這種方法相比采用完整病毒或真核細胞表達抗原作為免疫原具有操作相對簡單和實驗效率高的優(yōu)點。通過Western 印跡和免疫熒光檢測驗證了構建獲得的單抗2H11 可用于ZIKV 病毒感染后細胞或真核表達質粒轉染后細胞中表達的NS2B 蛋白的免疫檢測反應。在后續(xù)研究中，將進一步對單抗2H11 在ZIKV NS2B 蛋白上的結合表位進行鑒定?？紤]到黃病毒屬內各成員病毒的NS2B 蛋白存在一定的氨基酸序列保守性，該抗體是否與其他黃病毒的NS2B 蛋白具有反應性也有待進一步驗證。

綜上，本研究制備獲得了可與ZIKV NS2B 蛋白具有良好免疫反應活性的單克隆抗體2H11，可為NS2B 蛋白的鑒定、功能及抗病毒藥物等研究提供支持。