宗桂娟，尹海兵，李春筍，陳旭東，蔡南南，楊磊，趙斌，何松

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率逐年上升，嚴重危害人類健康［1］。多數(shù)胃癌病人即使采用圍手術(shù)期化療及輔助化療，生存率仍較低。因此尋找新的治療途徑如分子靶向治療成為胃癌研究的熱點［2-3］。K-RAS基因編碼的p21-ras蛋白位于細胞質(zhì)膜上轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞生長與分化的信號［4］。K-RAS突變主要發(fā)生在12、13和61編碼子上，這些突變可造成K-RAS基因激活［5-7］。結(jié)直腸癌病人存在40%～45%K-RAS基因突變，可導(dǎo)致細胞持續(xù)生長，抑制細胞凋亡［6］。目前K-RAS基因在結(jié)直腸癌方面的研究較多，但在胃癌中的研究卻鮮有報道［7］。本研究采用免疫組化法、PCR法檢測胃癌中K-RAS蛋白表達和基因狀態(tài)，將胃癌組織中KRAS蛋白表達、基因狀態(tài)與病人臨床參數(shù)進行分析。并探討K-RAS基因突變與蛋白表達水平是否存在一致性，旨在為胃癌靶向治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 314例胃癌組織樣本來自南通市腫瘤醫(yī)院。選取自2016年1月至2017年12月胃癌病人手術(shù)切除的標本。納入標準：無合并其他惡性腫瘤或者胃癌復(fù)發(fā)后再次手術(shù)者，臨床病理資料完整，術(shù)前未行放化療及其他抗腫瘤治療，手術(shù)病理診斷明確為胃癌。男233例，女81例。年齡范圍為32～88歲，中位年齡65歲。病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 實驗試劑 免疫組織化學(xué)法（免疫組化）所用抗體即用型試劑盒和一抗均購自Proteintech公司；人組織基因組核酸提取試劑盒（貨號為DE02003）及核酸提取儀均來自上?？埔嗌锟萍加邢薰尽?/p>

1.3 免疫組化 免疫組化染色采用EnVision（二步法）完成。K-RAS一抗工作濃度為1∶500，抗原修復(fù)方式為熱修復(fù)（Trish EDTA pH9.0）97℃，30 min。具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。結(jié)果判定：PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性的肝癌組織切片為陽性對照。Fromowitz綜合計分法將細胞著色強度與陽性細胞所占百分比二者綜合判定，陽性細胞百分數(shù)為10個視野陽性細胞平均數(shù)占其細胞總數(shù)的百分比：＜5%計0分；5%～25%計1分；26%～50%計2分；51%～75%計3分；＞75%計4分。細胞著色強度：不著色計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。二者積分相加：0～1分為陰性，≥2分為陽性［8］。

1.4 熒光定量PCR 基因組DNA的提取按照試劑盒說明書進行；本實驗所用引物為，正向5′-ATT TTT ATT ATA AGG CCT GCT G-3′和反向5′-CAA AGA ATGGTCCTGCACCAG-3′；20μLPCR反應(yīng)體系包括10 μL的2×Expfu Mix、15 pmol的正向引物、15 pmol的反向引物和3μL的樣品，加入PCR水體系補足至20μL；PCR程序如下：95℃預(yù)變性5 min，接著進行35個擴增循環(huán)：95℃10 s，58℃35 s，72℃15 s，隨后72℃5 min延伸。PCR產(chǎn)物測序由上?？埔嗌镉邢薰就瓿伞?/p>

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以例（%）表示，結(jié)果比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 K-RAS蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)病人的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無脈管侵犯等病理參數(shù)，將314例病人標本進行分組。通過統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示K-RAS蛋白表達陽性率為13.05%，其表達與病人性別（P＝0.585 8）、年齡（P＝0.648 5）、腫瘤大?。≒＝0.761 1）、脈管侵犯（P＝0.552 4）、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.506 4）；與組織學(xué)分化程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.019 5）。各組K-RAS蛋白表達情況見表1。

表1 K-RAS蛋白表達與胃癌臨床特征的關(guān)系/例

2.2 分析不同年齡、性別、組織學(xué)分級胃癌病人基因K-RAS突變情況 通過分析發(fā)現(xiàn)314例胃癌組織K-RAS基因狀態(tài)，其中K-RAS基因突變8例，突變率為2.54%，且K-RAS基因突變頻率在不同性別（P＝0.456 6）、年齡（P＝0.524 2）及組織學(xué)分級（P＝0.747 4）胃癌病人中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各組K-RAS基因突變頻率見表2。

表2 胃癌病人中不同年齡、性別、組織學(xué)分級群體中K-RAS基因的突變頻率/例（%）

2.3 K-RAS基因突變與蛋白表達的關(guān)系 PCR法檢測胃癌組織中K-RAS基因狀態(tài)，結(jié)果顯示K-RAS突變8例（突變率為2.54%），突變類型包括G12D（3例）、G13D（2例）、G12A（1例）、G12S（1例）、G13S（1例）；此外，基因突變病人中3例免疫組化檢測結(jié)果為陽性，即免疫組化結(jié)果與基因突變率結(jié)果相同者3例。K-RAS基因突變率與蛋白表達的檢出率不同（P＝0.037 7），故兩者關(guān)聯(lián)性低。見表3。

表3 K-RAS基因突變及K-RAS蛋白表達分布/例（%）

3 討論

RAS基因家族包括H-RAS、K-RAS、N-RAS基因，分別編碼H-RAS、K-RAS、N-RAS蛋白，它們具有相似的結(jié)構(gòu)和功能［9］。RAS蛋白位于細胞膜內(nèi)側(cè)，將EGFR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給MAPKs，進而調(diào)控細胞的生長、增殖及血管生成［10-11］。一般情況下K-RAS基因處于相對靜止狀態(tài)，當(dāng)受到持續(xù)刺激作用與政策細胞激活K-RAS，導(dǎo)致細胞惡性生長，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展［12-13］。因此研究K-RAS在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要的臨床意義。

本研究結(jié)果顯示胃癌K-RAS蛋白表達與病人性別、年齡、腫瘤大小、脈管侵犯、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系（P＞0.05）；但K-RAS蛋白表達與分化程度密切相關(guān)（P＜0.05），提示K-RAS可能參與了胃癌的發(fā)展進程。Kikuchi等應(yīng)用免疫組化法研究K-RAS在80例胃癌表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著胃癌分化程度的增加則表達升高，與本研究結(jié)果一致［14］。

K-RAS基因突變率在不同腫瘤中明顯不同。文獻報道胰外分泌腺癌基因突變率高達90%，結(jié)腸癌為40%～50%，肺癌和膀胱癌為40%，而胃癌在10%以下［15］。本實驗檢測314例胃癌組織K-RAS基因狀態(tài)，其中K-RAS基因突變8例，突變率為2.54%。K-RAS基因突變結(jié)果與國外研究一致。KRAS基因在不同性別、年齡、組織分化之間的突變率無顯著差異。K-RAS突變與病人缺乏對EGFR單抗的反應(yīng)有關(guān)，突變者不適用西妥昔單抗治療［16］。2010年NCCN臨床指南中推薦：結(jié)直腸癌病人在接受西妥昔單抗治療前，進行K-RAS基因突變檢測，確定是否接受該靶向治療［17-18］。另外本研究中KRAS蛋白的陽性率為13.05%，其蛋白陽性率遠高于基因突變率。因此K-RAS的免疫組化結(jié)果不能替代基因突變檢測結(jié)果，對于考慮選用西妥昔單抗治療的病人，可以采用熒光定量PCR法檢測EGFR及K-RAS基因狀態(tài)。

綜上，K-RAS在胃癌中的蛋白表達可能作為判斷胃癌惡性程度的分子生物學(xué)標志物。K-RAS基因的突變狀態(tài)和靶向EGFR單克隆抗體的治療效果相關(guān)，因此胃癌病人可通過K-RAS基因檢測結(jié)果采用個體化治療。