高 超，田彥明，丁博月，張 翼

1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院放療科，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)生理教研室，河北 石家莊 050017

Musashi1（Msi1）屬于RNA結(jié)合蛋白家族的一員，是RNA轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控者，通常在腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)祖細(xì)胞和干細(xì)胞上高表達(dá)，對于維持自我更新與分化之間的平衡具有重要作用，因此其功能或表達(dá)異常能夠以多種方式影響細(xì)胞的生理過程［1］。目前已在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)Msi1高表達(dá)，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［2-6］，但至今Msi1在結(jié)腸癌中的確切作用及機(jī)制仍不明確。最新研究表明，Msi1主要通過與靶基因mRNA 3’-非編碼區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）特異性地結(jié)合調(diào)控其下游基因表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡［7］。據(jù)報(bào)道p27 mRNA的3’-UTR區(qū)存在Msi1的潛在結(jié)合位點(diǎn)［8］。因此推測Msi1可能通過調(diào)節(jié)p27進(jìn)而參與結(jié)腸癌的演進(jìn)過程，本研究通過慢病毒沉默Msi1基因，明確Msi1對結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、克隆形成能力及細(xì)胞周期的影響，并利用熒光素酶報(bào)告載體證實(shí)Msi1通過靶向調(diào)節(jié)p27發(fā)揮調(diào)控作用，闡明Msi1作用的分子機(jī)制，完善結(jié)腸癌中Msi1的信號通路，為結(jié)腸癌精準(zhǔn)治療提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 慢病毒載體構(gòu)建

由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建Msi1基因沉默重組慢病毒載體GV248-Msi1-shRNA和陰性對照慢病毒載體GV248-NCshRNA，共設(shè)計(jì)2條Msi1目標(biāo)序列，最終選取干擾序列：5’-TGTTACATGGTGTTTCGAA-3’，同時(shí)設(shè)計(jì)一條陰性對照序列：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組轉(zhuǎn)染

將購自美國ATCC公司的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116用10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液（美國Gibco公司）常規(guī)培養(yǎng)。每孔5×104個(gè)目的細(xì)胞接種于6孔板中，按病毒感染復(fù)數(shù)值為20，分別加入適量的陰性對照病毒載體和沉默Msi1病毒載體的病毒液，感染72 h后觀察熒光表達(dá)情況評估感染效率，通過嘌呤霉素（美國Sigma公司）加壓篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)將結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系分為未做任何處理的空白組（Blank組）、轉(zhuǎn)染GV248-Msi1-shRNA的沉默組（Msi1-shRNA組）和轉(zhuǎn)染GV248-NC-shRNA的陰性對照組（NC組）

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測mRNA表達(dá)

利用TRIzol裂解液［寶生物工程（大連）有限公司］提取各組細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）合成cDNA。由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)的Msi1、p27和GAPDH引物見表1。反應(yīng)體系為20 μL：10 μL SYBR Premix、cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL及RNase-Free H2O 8 μL。采用7500型RTFQ-PCR（美國ABI公司）進(jìn)行RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)。mRNA的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt分析法。

表1 RTFQ-PCR引物列表Tab.1 Primer list of RTFQ-PCR

1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測細(xì)胞增殖活性

取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以4×103個(gè)/孔接種于96孔板中，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h后，分別向每孔加入10 μL CCK-8溶液（日本Dojindo公司），37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處的吸光度（D）值，細(xì)胞活性%=（D實(shí)驗(yàn)組/D空白組）×100%。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力

取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以1 000個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)則終止培養(yǎng)；每孔加入1 mL甲醇室溫下固定細(xì)胞20 min；然后每孔加入0.2%結(jié)晶紫染色液染色30 min。顯微鏡下計(jì)數(shù)多于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞周期分布

取對數(shù)生長期的3組細(xì)胞，各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入70%的乙醇于4 ℃固定過夜；上機(jī)前每管加入2.5 μL的RNase A（美國BD公司）室溫溫育20 min，再加入25 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液（美國BD公司），室溫避光保存15 min，用FACSAria Ⅱ FCM（美國BD公司）檢測，數(shù)據(jù)由Modfit軟件分析。

1.7 裸小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測體內(nèi)成瘤能力

用注射器將各組細(xì)胞接種于BALB/c裸小鼠（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK京2009-0008）右上肢外側(cè)皮下（5×106個(gè)細(xì)胞/只），每周觀察裸小鼠的一般狀態(tài)及腫瘤形態(tài)，并記錄裸小鼠的移植瘤體積，V（cm3）＝長×寬2/2。于接種后第8周處死裸小鼠，剝離瘤塊后稱其質(zhì)量，抑瘤率（%）＝［（對照組平均瘤質(zhì)量-沉默組平均瘤質(zhì)量）/對照組平均瘤質(zhì)量］×100%。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白水平

按照蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）操作說明，分別提取各組細(xì)胞總蛋白。采用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)，隨后于恒壓100 V轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)印后的PVDF膜使用5%的脫脂奶粉封閉2.5 h，加一抗（英國Abcam公司）、β-actin（英國Abcam公司），4 ℃冰箱過夜。之后加入對應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗IgG（英國Abcam公司）；采用ECL檢測，GenoSens凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）分析條帶灰度值。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

PubMed檢索顯示，p27 mRNA的3’-UTR區(qū)可能存在Msi1的潛在結(jié)合位［（G/A）UnAGU，n=1～3］［8］。用Primer 5軟件設(shè)計(jì)p27引物，詳見表2，擴(kuò)增出p27的3’-UTR野生型（wild type，WT）和突變型（mutant，MU）片段，將p27 mRNA3’-UTR中Msi1的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)由WT1（ATAGT）和WT2（GTAGT）突變?yōu)镸U1（CGCAG）和MU2（AGCAG），再把野生型（WT1和WT2）和突變型（MU1和MU2）分別克隆進(jìn)入雙熒光素酶真核表達(dá)載體pMIR-Report（美國Ambion公司）中。檢測報(bào)告基因質(zhì)粒與海腎質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體（美國Invitrogen公司）轉(zhuǎn)染說明操作。轉(zhuǎn)染48 h后加入熒光素酶檢測試劑，測定螢火蟲熒光素酶的活性，隨后加入Stop＆Glo試劑測定海腎熒光素酶的活性，相對熒光素酶活性以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性之比表示。

表2 p27引物列表Tab.2 Primer list of p27

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染HCT116細(xì)胞

慢病毒感染人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株72 h后，熒光顯微鏡觀察感染細(xì)胞綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達(dá)情況，100倍視野計(jì)數(shù)各組熒光細(xì)胞數(shù)（NC組：538.33±11.06，Msi1-shRNA組：553.33±15.04）和總細(xì)胞數(shù)（NC組：581.67±21.20，Msi1-shRNA組：597.33±28.02），熒光細(xì)胞占比即為感染效率，在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞感染效率在90%以上（圖1A）。RTFQ-PCR結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染后Blank組、NC組和Msi1-shRNA組mRNA相對表達(dá)量分別為1.079±0.099、1.002±0.078和0.262±0.053，慢病毒成功干擾Msi1-shRNA組細(xì)胞Msi1表達(dá)，相對于陰性對照組沉默效率為73.85%（P＜0.001，圖1B）。

圖1 慢病毒抑制Msi1表達(dá)水平Fig.1 Lentiviral-mediated RNAi suppressed expression of Msi1

2.2 沉默Msi1基因?qū)CT116細(xì)胞增殖活性的影響

慢病毒感染HCT116細(xì)胞后，采用CCK-8檢測各組細(xì)胞的生長情況，酶標(biāo)儀檢測3組細(xì)胞24、48、72 h的450 nm處的D值，根據(jù)D值繪制細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果顯示，Msi1-shRNA組細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的增殖速度均明顯低于Blank組及NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Msi1-shRNA組24、48、72 h細(xì)胞活性相對于Blank組分別為85.81%±2.26%、83.13%±2.03%、74.48%±3.08%，而Blank組與NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示沉默Msi1基因表達(dá)后，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的增殖能力明顯降低（圖2）。

圖2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測沉默Msi1基因后HCT116細(xì)胞生長曲線Fig.2 Growth curve of HCT116 cells after Msi1 gene silencing detected by CCK-8 assay

2.3 沉默Msi1基因?qū)CT116細(xì)胞克隆形成能力的影響

通過平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測慢病毒沉默HCT116細(xì)胞Msi1表達(dá)后對克隆形成能力的影響。3組細(xì)胞以1 000個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)則終止培養(yǎng)，顯微鏡下計(jì)數(shù)多于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。結(jié)果顯示，Msi1-shRNA組細(xì)胞形成集落數(shù)（267.67±39.81）明顯低于Blank組（474.00±79.30）和NC組（457.33±53.58），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而Blank組與NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示沉默Msi1基因表達(dá)能夠顯著降低結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞克隆形成能力（圖3）。

2.4 沉默Msi1基因?qū)CT116細(xì)胞周期的影響

通過FCM檢測慢病毒沉默HCT116細(xì)胞Msi1表達(dá)后對細(xì)胞周期的影響。慢病毒感染HCT116細(xì)胞后，取對數(shù)生長期的3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集，加入70%的乙醇于4 ℃固定過夜，使用FCM PI染色法上機(jī)檢測各組細(xì)胞周期變化，結(jié)果顯示，與Blank組（42.67±3.37）和NC組（44.20±4.60）相比較，Msi1-shRNA組G0/G1期細(xì)胞百分比（54.83%±4.09%）顯著增加（P＜0.05）；Msi1-shRNA組S期細(xì)胞百分比（8.14%±1.81%）與Blank組（13.13%±1.45%）、NC組（13.70%±2.13%）相比明顯減少（P＜0.05）；而Msi1-shRNA組、Blank組和NC組的G2/M期細(xì)胞百分比分別為37.03%±5.28%、44.17%±4.35%和42.03%±2.61%，Msi1-shRNA組G2/M期細(xì)胞有減少趨勢（P＞0.05），Blank組與NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示沉默Msi1基因使結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，S期細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞分裂顯著減緩（圖4）。

圖3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測沉默Msi1基因?qū)CT116細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig.3 Effect of Msi1 gene silencing on colony forming ability of HCT116 cells detected by clone formation assay

圖4 FCM檢測沉默Msi1基因?qū)CT116細(xì)胞周期的影響Fig.4 Effect of Msi1 gene silencing on cell cycle of HCT116 cells detected by FCM

2.5 沉默Msi1基因?qū)CT116細(xì)胞裸小鼠移植瘤的影響

通過裸小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測慢病毒沉默Msi1基因?qū)CT116細(xì)胞體內(nèi)成瘤性的影響。用注射器將3組細(xì)胞分別接種于BALB/c裸小鼠右上肢外側(cè)皮下，每周觀察裸小鼠的的移植瘤體積，V（cm3）＝長×寬2/2。于接種后第8周處死裸小鼠，剝離瘤塊后稱重。根據(jù)測量得到的移植瘤體積繪制其生長曲線。與Blank組和NC組相比，Msi1-shRNA組成瘤時(shí)間較晚且生長緩慢（P＜0.05，圖5），并且Msi1-shRNA組腫瘤質(zhì)量［（0.39±0.14）g］明顯小于Blank組［（0.93±0.23）g］及NC組［（0.84±0.18）g］（P＜0.01），抑瘤率為58.06%，Blank組及NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示沉默Msi1基因可顯著抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞在體內(nèi)的生長（圖6）。

圖5 沉默Msi1基因?qū)CT116細(xì)胞移植瘤生長的影響Fig.5 Effect of Msi1 gene silencing on xenograft tumor growth of HCT116 cells

圖6 沉默Msi1基因?qū)CT116細(xì)胞移植瘤重量的影響Fig.6 Effect of Msi1 gene silencing on xenograft tumor weight of HCT116 cells

2.6 沉默Msi1基因?qū)CT116細(xì)胞p27 mRNA表達(dá)的影響

采用RTFQ-PCR檢測慢病毒沉默HCT116細(xì)胞Msi1基因后對p27mRNA表達(dá)的影響，mRNA的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt分析法。結(jié)果顯示，Blank組、NC組與Msi1-shRNA組p27 mRNA表達(dá)量分別為0.992±0.111、1.006±0.142和0.968±0.121，3組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示沉默Msi1基因并不影響p27 mRNA表達(dá)（圖7）。

2.7 沉默Msi1對HCT116細(xì)胞p27蛋白水平的影響

采用Western blot檢測慢病毒沉默HCT116細(xì)胞Msi1后對p27蛋白水平的影響。Msi1-shRNA組p27蛋白相對水平（0.602±0.105）明顯高于Blank組（0.187±0.049）及NC組（0.228±0.072）（P＜0.01），而Blank組及NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示降低Msi1表達(dá)可以上調(diào)p27蛋白水平（圖8）。

圖7 RTFQ-PCR檢測各組細(xì)胞p27 mRNA相對表達(dá)水平Fig.7 The p27 mRNA expression of each group detected by RTFQ-PCR

圖8 Western blot檢測各組細(xì)胞p27蛋白相對水平Fig.8 The p27 protein level of each group detected by Western blot

2.8 Msi1通過p27 mRNA的特定位點(diǎn)抑制p27表達(dá)

Msi1主要通過與下游靶基因mRNA 3’-UTR特定序列結(jié)合而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中將靶基因p27 mRNA 3’-UTR區(qū)的野生型（WT1和WT2）和突變型（MU1和MU2）結(jié)合序列克隆至載體中報(bào)告基因熒光素酶的下游，構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒，并送至上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司進(jìn)行測序分析，證實(shí)已將p27 mRNA 3’-UTR區(qū)的野生型和突變型結(jié)合序列克隆入pMIRReport載體（圖9）。Msi1可通過該結(jié)合序列調(diào)控?zé)晒馑孛傅谋磉_(dá)，檢測熒光素酶的活性變化可以鑒定Msi1對p27是否有調(diào)控作用。將構(gòu)建的p27 3’-UTR區(qū)的熒光素酶報(bào)告載體（p27野生型）及其突變體（p27突變型），分別轉(zhuǎn)染3組細(xì)胞。結(jié)果顯示，與Blank組（0.373±0.045）、NC組（0.438±0.072）相比，Msi1-shRNA組（0.954±0.075）p27野生型的熒光素酶活性明顯上升（P＜0.001），提示Blank組和NC組中高表達(dá)的Msi1可以和野生型p27 mRNA 3’-UTR特定序列結(jié)合并抑制熒光素酶的表達(dá)，而沉默組Msi1低表達(dá)，因此熒光素酶的表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，各組Msi1反應(yīng)位點(diǎn)突變體p27突變型的熒光素酶活性則沒有明顯變化（P＞0.05），表明Msi1是通過與p27 mRNA 3’-UTR區(qū)結(jié)合從而抑制了p27蛋白表達(dá)（圖10）。

圖9 2種質(zhì)粒測序圖Fig.9 Sequencing map of 2 plasmids

圖10 Msi1通過結(jié)合p27 mRNA的特定位點(diǎn)抑制p27蛋白表達(dá)Fig.10 Msi1 inhibited p27 protein expression by binding to specific sites of p27 mRNA

3 討 論

Msi1是一種進(jìn)化保守的RNA結(jié)合蛋白，它的作用與轉(zhuǎn)錄因子類似，是干細(xì)胞的重要標(biāo)志物，但在分化后的細(xì)胞中幾乎檢測不到［9］。最近的研究［2-6］表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌和乳腺癌等均發(fā)現(xiàn)Msi1異常高表達(dá)，并且Msi1高表達(dá)被認(rèn)為與許多惡性腫瘤分期及增殖活性相關(guān)，并提示疾病的預(yù)后較差，提示Msi1在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，可能是一種原癌基因，但至今在結(jié)腸癌中的確切作用機(jī)制仍然未知。本研究利用慢病毒成功構(gòu)建Msi1穩(wěn)定低表達(dá)的HCT116細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)沉默Msi1基因后，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞G0/G1期阻滯，S期細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞分裂顯著減緩，并造成細(xì)胞體外增殖活性及克隆形成能力明顯下降。另外，裸小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)表明，沉默Msi1基因可顯著抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤性。上述結(jié)果表明，Msi1在結(jié)腸癌演進(jìn)過程中有重要影響，沉默Msi1基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞具有生長抑制作用。Chen等［10］在肝細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沉默Huh7細(xì)胞Msi1基因后，細(xì)胞增殖能力及克隆能力明顯受到抑制，并在G1/S期轉(zhuǎn)換時(shí)引起細(xì)胞周期停滯。Wang等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，干擾口腔鱗狀細(xì)胞癌中Msi1表達(dá)，將導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力顯著下降，出現(xiàn)細(xì)胞周期停滯于S期，因此認(rèn)為Msi1是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的核心調(diào)節(jié)因子。以上研究報(bào)道與本研究結(jié)果相似。

目前Msi1通過何種機(jī)制發(fā)揮其癌基因的作用仍不很明確。Msi1是RNA轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控者，主要通過與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的非翻譯區(qū)域的序列發(fā)生特異結(jié)合，從而影響翻譯的過程。之前有研究［7］發(fā)現(xiàn)，Msi1可以通過與下游靶基因mRNA 3’-UTR區(qū)特異性結(jié)合抑制翻譯的過程，進(jìn)而調(diào)控其下游基因表達(dá)，最終參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡。最新研究［8］也表明，p27 mRNA 3’-UTR區(qū)存在Msi1的潛在結(jié)合位點(diǎn)。p27作為細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是一種抑癌基因，并且在結(jié)腸癌組織中p27蛋白的表達(dá)明顯降低，且其表達(dá)的陽性率與結(jié)腸癌的分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)［12-13］，其從生物功能上可能是最直接地影響G1/S期限制位點(diǎn)的調(diào)控因子，p27蛋白高表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期停滯在G1期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖［14-16］。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也印證了上述觀點(diǎn)，沉默結(jié)腸癌細(xì)胞Msi1基因表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)沉默組p27蛋白水平顯著上調(diào)，通過FCM觀察到沉默組腫瘤細(xì)胞發(fā)生了明顯的G0/G1期阻滯，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，而且CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)，沉默組細(xì)胞體內(nèi)外增殖能力及克隆形成能力均受到明顯抑制。因此推測，Msi1可能正是通過與其靶基因p27 mRNA 3’-UTR區(qū)特異性結(jié)合，抑制其翻譯，降低其蛋白水平，進(jìn)而參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。為驗(yàn)證該假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)首先需要證明Msi1作用于p27 mRNA翻譯階段，而對p27 mRNA水平并無影響。因此，本實(shí)驗(yàn)針對細(xì)胞周期調(diào)控因子設(shè)計(jì)了p27的特異性引物，采用RTFQ-PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測，并用Western blot檢測了蛋白水平。結(jié)果顯示，與Blank組及NC組相比，沉默組細(xì)胞中p27基因的mRNA水平無明顯改變，但是其蛋白水平明顯上調(diào)，說明Msi1可以抑制p27 mRNA的翻譯，從而負(fù)向調(diào)節(jié)p27的蛋白水平，而對p27 mRNA表達(dá)無影響。為進(jìn)一步挖掘沉默Msi1上調(diào)p27蛋白水平的機(jī)制，進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，Msi1能明顯抑制p27 3’-UTR區(qū)野生型的熒光素酶活性，但p27 3’-UTR區(qū)中Msi1的結(jié)合區(qū)域突變時(shí)，Msi1抑制p27 3’-UTR區(qū)的熒光素酶活性現(xiàn)象消失，提示結(jié)腸癌中Msi1能夠與p27 mRNA 3’-UTR區(qū)特異性的結(jié)合，進(jìn)而靶向抑制p27蛋白的水平從而發(fā)揮其癌基因的作用，這與Liu等［17］在宮頸癌中的研究結(jié)果相似。

綜上所述，p27是Msi1的靶基因，沉默Msi1后可以通過上調(diào)p27蛋白水平，導(dǎo)致結(jié)腸癌HC116細(xì)胞G0/G1期阻滯，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本研究存在一定局限性，如未對p27進(jìn)行靶基因的功能驗(yàn)證，有待后續(xù)進(jìn)一步研究，從而系統(tǒng)地解析Msi1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為結(jié)腸癌的預(yù)防、診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。