王承玉，李杰峰，趙志強(qiáng)，段寶寧，楊威，馬玉忠

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071001；3.邯鄲市飼料工業(yè)辦公室，河北 邯鄲 056002)

豬圓環(huán)病毒是一種無(wú)囊膜共價(jià)閉合的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，是目前已知最小的動(dòng)物病毒[1]，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬[2].豬圓環(huán)病毒現(xiàn)有3個(gè)基因型：豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)[3-4].PCV1是Tischer等[4]首次從豬腎傳代細(xì)胞系(PK-15)污染的病毒中分離得到的不具有致病性的病毒.PCV2是從患有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的豬群中分離得到的[5]，該病毒具有很高的致病性，其感染后會(huì)引起豬圓環(huán)病毒病(PCVD)，會(huì)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6].2015年，北卡羅來(lái)納州的一個(gè)農(nóng)場(chǎng)母豬死亡率增加，爆發(fā)了豬皮炎腎病綜合征(PDNS)，Palinski等[7]通過(guò)宏基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了新的豬圓環(huán)病毒，并將其命名為PCV3.隨后在英國(guó)、波蘭、意大利、韓國(guó)、中國(guó)也檢測(cè)出該病[8-12]，截止到2018年，中國(guó)先后在山東、吉林、黑龍江、遼寧、廣東、江蘇等省市[12-16]相繼檢測(cè)到PCV3.PCV3的基因長(zhǎng)度為2 000 bp，有11個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frames,ORFs)，主要有兩個(gè)編碼蛋白，即ORF1(Rep)、ORF2(Cap)[17]，兩者與PCV2的功能相似.ORF1是PCV上最大的編碼區(qū)，編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，而ORF2編碼與病毒結(jié)構(gòu)有關(guān)的Cap蛋白，為主要的免疫原性蛋白.在我國(guó)PCV3有3a和3b兩個(gè)亞型[18].目前對(duì)PCV3的相關(guān)研究很少，本文通過(guò)擴(kuò)增一株P(guān)CV3的全基因組序列，對(duì)其序列特征進(jìn)行分析，并將GenBank上所有的PCV3全基因組序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，以期了解本毒株的結(jié)構(gòu)特征，為進(jìn)一步的致病機(jī)理研究及疫苗研制提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

選取2015年于華北地區(qū)采集的豬病變淋巴結(jié)進(jìn)行PCV3病原檢測(cè).

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；2×ES Taq MasterMix(Dye)和DL2000 DNA Marker購(gòu)自康維世紀(jì)生物科技有限公司；50×TAE緩沖液和瓊脂糖購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司.

1.3 病毒DNA的提取

從病變淋巴結(jié)上取50 mg樣品，置于1.5 mL離心管中，加入200 μL生理鹽水，在勻漿儀上研磨，10 000 r/min離心1 min，取沉淀，提取DNA，最后加入100 μL TE緩沖液對(duì)DNA進(jìn)行溶解，置于-80 ℃保存.

1.4 PCV3的檢測(cè)

根據(jù)GenBank中的PCV3全基因組序列，利用NCBI在線引物設(shè)計(jì)平臺(tái)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，引物序列為F：5′-TTGTGGTGCTACGAGTGTCC-3′；R：5′-CGTCTCCGTCAGAATCCGAG-3′，擴(kuò)增片段大小為418 bp，引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成.構(gòu)建20 μL PCR反應(yīng)體系：2×ES Taq MasterMix(Dye)10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、模板1 μL、ddH2O 8 μL.PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR反應(yīng)結(jié)果.

1.5 PCV3全基因組序列擴(kuò)增及測(cè)序

PCV3是一個(gè)環(huán)狀DNA病毒，為了保證病毒擴(kuò)增產(chǎn)物的完整性，參照文獻(xiàn)[19]采用兩對(duì)引物擴(kuò)增其全基因組序列，PCV3-1-F：5′-TAGTATTACCCGGCACCTCGGAACC-3′，PCV3-1-R：5′-ACAGGTAAACGCCCTCGCATGTGGG-3′，擴(kuò)增片段大小為1257 bp；PCV3-2-F：5′-TTGCACTTGTGTACAATTATTGCG-3′，PCV3-2-R：5′-ATCTTCAGGACACTCGTAGCACCAC-3′，擴(kuò)增片段大小為1 075 bp,引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成.構(gòu)建50 μL PCR反應(yīng)體系：2×ES Taq MasterMix(Dye)25 μL、上游引物1.25 μL、下游引物1.25 μL、模板2.5 μL、ddH2O 20 μL.PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.1.5%瓊脂糖凝膠電泳后成像觀察PCR的反應(yīng)結(jié)果.并將PCR產(chǎn)物送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測(cè)序.

1.6 PCV3河北株全基因組序列分析

利用Vector NTI軟件繪制PCV3河北株全基因組的基因圖譜，在GenBank中選取已發(fā)表的全部國(guó)內(nèi)外PCV3毒株的全基因組序列，應(yīng)用DNA Star軟件包中的MegAlign和EditSeq軟件對(duì)基因序列進(jìn)行編輯、拼接，并對(duì)核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，利用MEGA-X軟件的最大似然法進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析并生成基因進(jìn)化樹(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV3檢測(cè)

利用檢測(cè)引物，對(duì)病變淋巴結(jié)組織進(jìn)行PCV3檢測(cè)，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后成像結(jié)果見(jiàn)圖1.淋巴結(jié)組織檢測(cè)出PCV3，其條帶大小為418 bp，因此選取其DNA作為PCR模板進(jìn)行PCV3全基因組序列擴(kuò)增.

2.2 PCV3全基因組序列擴(kuò)增

為了獲得PCV3全基因組序列，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)PCV3的DNA模板分兩段擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果顯示成功擴(kuò)增出兩段序列，其條帶大小分別為1 257、1 075 bp(圖2～3).對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得1株P(guān)CV3全基因組序列，在GenBank上進(jìn)行序列比對(duì)，并將其上傳到GenBank(登錄號(hào)：MK105924).

M：DL2000 DNA Marker；1：淋巴結(jié)組織；2：陰性對(duì)照.M：DL2000 DNA Marker；1：Lymph node tissue；2：Negative control.圖1 PCV3檢測(cè)結(jié)果Figure 1 PCV3 test results

M：DL2000 DNA Marker；1： PCV3-1的PCR產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照. M：DL2000 DNA Marker；1： PCR product of PCV 3-1；2：Negative control.圖2 PCV3-1的PCR產(chǎn)物Figure 2 PCR product of PCV3-1

M：DL2000 DNA Marker；1： PCV3-2的PCR產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照. M：DL2000 DNA Marker；1： PCR product of PCV 3-2；2：Negative control.圖3 PCV3-2的PCR產(chǎn)物Figure 3 PCR product of PCV3-2

2.3 PCV3河北株序列特征分析

對(duì)所獲得的PCV3河北株繪制基因圖譜(圖4)，圖4可以看到基因圖譜主要有2個(gè)開(kāi)檔閱讀框(ORFs)，分別為ORF1、ORF2，每個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼的蛋白質(zhì)都大于200個(gè)氨基酸，在ORF1和ORF2之間被預(yù)測(cè)含有一個(gè)與PCV1相同的由9個(gè)堿基(TAGTATTAC)構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，ORF1和ORF2的編碼方向相反，PCV1與PCV2的ORF1的起始密碼子均為ATG，而在PCV3的ORF1中缺少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的起始密碼子(ATG).

在這兩個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框中，ORF1是最大的開(kāi)放閱讀框其編碼了297個(gè)氨基酸，與PCV1和PCV2的REP蛋白及中國(guó)的蝙蝠圓環(huán)病毒的同源性分別為：51%、50.3%和51.9%.ORF2編碼的Cap蛋白與Rep蛋白編碼方向相反，其編碼了215個(gè)氨基酸，與PCV1和PCV2的Cap蛋白及鴨圓環(huán)病毒的同源性分別為40.4%、40.6%和48.2%.

圖4 PCV3河北株全基因組基因圖譜Figure 4 Genomic map of PCV3 Hebei strain complete genome

2.4 河北省PCV3 Cap蛋白核苷酸序列同源性及遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

為深入分析PCV3河北株全基因組序列特征，將所獲得的PCV3毒株的Cap蛋白與河北省其他9株P(guān)CV3的Cap蛋白進(jìn)行核苷酸序列同源性和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析(圖5～6)，從核苷酸序列同源性分析(圖5)中發(fā)現(xiàn)這10株P(guān)CV3毒株的Cap蛋白的同源性在97.8%～99.8%，其中與河北株(GenBank登錄號(hào)：MF318449)Cap蛋白同源性最高，為99.8%；在遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖6)中，可看到有兩個(gè)不同的分支，分為兩個(gè)亞型3a和3b，其中所獲得PCV3毒株的Cap蛋白為3b亞型，其與河北株(GenBank登錄號(hào)：MF318448)和河北株(GenBank登錄號(hào)：MF318449)處于一個(gè)大分支，而與河北株(GenBank登錄號(hào)：MF318449)處于同一個(gè)小分支，說(shuō)明其三者親緣關(guān)系較近，而所獲得的PCV3河北株與河北株(GenBank登錄號(hào)：MF318449)親緣關(guān)系更接近，且二者的核苷酸同源性也最高，為99.8%.

圖右側(cè)標(biāo)注毒株信息為“地區(qū)-GenBank登錄號(hào)”The information on the right side of the figure is “Region-GenBank Registration Number”.圖5 河北省PCV3 Cap蛋白核苷酸序列同源性比較Figure 5 Comparison of nucleotide sequence homology of PCV3 Cap protein in Hebei Province

2.5 PCV3全基因組核苷酸序列同源性分析

為了探究PCV3河北株全基因組序列同源性，對(duì)所獲得的PCV3毒株與其他國(guó)家及地區(qū)的43株P(guān)CV3和1株P(guān)CV1、1株P(guān)CV2的全基因組進(jìn)行核苷酸序列同源性分析(圖7).結(jié)果顯示，所獲得毒株與其他43株P(guān)CV3全基因組核苷酸序列的同源性在98.7%～99.3%，與國(guó)內(nèi)其他省PCV3全基因組核苷酸序列的同源性在98.7%～99.1%，與國(guó)外PCV3全基因組核苷酸序列的同源性在98.8%～99.3%，由此可見(jiàn)全球PCV3的全基因組核苷酸序列之間的同源性都較高，與俄羅斯PCV3(GenBank登錄號(hào)：MG679916)全基因組核苷酸序列的同源性最高，為99.3%；44株P(guān)CV3與PCV1、PCV2的全基因組核苷酸序列的同源性在46.1%～46.7%、45.9%～46.3%，與PCV1、PCV2全基因組核苷酸序列之間的同源性均低于50%，PCV1、PCV2和PCV3全基因組序列的同源性存在著較大的差異.

2.6 PCV3全基因組遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

為了對(duì)PCV3河北株全基因組序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，對(duì)所獲得的PCV3河北株與其他國(guó)家及地區(qū)的43株P(guān)CV3和1株P(guān)CV1、1株P(guān)CV2的全基因組進(jìn)行基因進(jìn)化樹(shù)分析.由圖8可看到有兩個(gè)大的分支，PCV3處于一個(gè)分支，PCV1和PCV2處于一個(gè)分支，由此可得出PCV3與PCV1和PCV2的親緣關(guān)系不近且屬于兩個(gè)不同的基因型，PCV1和PCV2在同一個(gè)分支其親緣關(guān)系較近；PCV3大分支中又有兩個(gè)小分支，分為兩個(gè)亞型3a和3b，所獲得的PCV3河北株為3b亞型，其與重慶PCV3毒株(GenBank登錄號(hào)：KY075992)處于同一個(gè)小分支，親緣關(guān)系更為接近.

圖中標(biāo)注毒株信息為“地區(qū)-GenBank登錄號(hào)”The information marked in the figure is “Region-GenBank Registration Number”.圖6 河北省PCV3 Cap蛋白遺傳進(jìn)化樹(shù)Figure 6 Phylogenetic tree of PCV3 Cap protein in Hebei Province

圖右側(cè)標(biāo)注毒株信息為“地區(qū)-GenBank登錄號(hào)”The information on the right side of the figure is “Region-GenBank Registration Number”.圖7 部分PCV3全基因組核苷酸序列同源性比較Figure 7 Comparison of the nucleotide homology of the complete genome among several PCV3 strains

2.7 全球PCV3全基因組遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

為了分析全球PCV3遺傳進(jìn)化特點(diǎn)，選取GenBank上已發(fā)表的全部國(guó)內(nèi)外175株(包含所獲得的PCV3河北株)PCV3的全基因組序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹(shù)分析(圖9～10)，同樣有兩個(gè)不同的分支，分為兩個(gè)亞型3a和3b，通過(guò)基因進(jìn)化樹(shù)繪制表1和表2.由表1可知：國(guó)內(nèi)和國(guó)外占全球PCV3總數(shù)的比例分別是61.1%和38.9%，北方和南方占國(guó)內(nèi)PCV3總數(shù)的比例分別是25.2%和74.8%，亞洲、美洲和歐洲占國(guó)外PCV3總數(shù)的比例分別是30.9%、13.2%和55.9%，由次推斷PCV3在國(guó)內(nèi)外及各地區(qū)的分布存在著差異.由表2可知：北方和南方占國(guó)內(nèi)PCV3a亞型總數(shù)的比例分別是18%和82%，北方和南方占國(guó)內(nèi)PCV3b亞型總數(shù)的比例分別是31.6%和68.4%，北方的PCV3a和PCV3b占北方PCV3亞型總數(shù)的比例分別是33.3%和66.7%，由此推斷PCV3亞型的分布在國(guó)內(nèi)不同的地域存在著差異，且北方以PCV3b為多數(shù)；從國(guó)外PCV3亞型的數(shù)量可知：亞洲、美洲和歐洲占國(guó)外PCV3a亞型總數(shù)的比例分別是52.4%、44.4%和23.7%，亞洲、美洲和歐洲占國(guó)外PCV3b亞型總數(shù)的比例分別是47.6%、55.6%和76.3%，歐洲的PCV3a和PCV3b占?xì)W洲PCV3亞型總數(shù)的比例分別是23.7%和52.4%，國(guó)外PCV3a和PCV3b占其總數(shù)的比例分別是35.3%和64.7%，全球PCV3a和PCV3b占其總數(shù)的比例分別是42.3%和57.7%，由此可知PCV3亞型的分布在國(guó)外不同的地域存在著差異，PCV3亞型分布在歐洲、國(guó)外及全球存在著差異，且以PCV3b亞型為多數(shù).

圖中標(biāo)注毒株信息為“地區(qū)-GenBank登錄號(hào)”The information marked in the figure is “Region-GenBank Registration Number”.圖8 部分PCV3遺傳進(jìn)化樹(shù)Figure 8 Phylogenetic tree several PCV3 strains

圖中標(biāo)注毒株信息為“地區(qū)-GenBank登錄號(hào)”The information marked in the figure is “Region-GenBank Registration Number”.圖9 國(guó)內(nèi)南方和北方PCV3遺傳進(jìn)化樹(shù)Figure 9 Phylogenetic tree of PCV3 strains in south and north of China

圖中標(biāo)注毒株信息為“地區(qū)-GenBank登錄號(hào)”The information marked in the figure is “Region-GenBank Registration Number”.圖10 亞洲、美洲、歐洲PCV3遺傳進(jìn)化樹(shù)Figure 10 Phylogenetic tree of PCV3 strains in Asia,American and Europe

3 討論

PCV3是一種新型病毒，其主要的臨床癥狀表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)、死胎和仔豬腹瀉、皮炎等癥狀[7].自2016年在美國(guó)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，歐洲地區(qū)[8-10]、日本、韓國(guó)[11]及中國(guó)等亞洲地區(qū)[12-16]也相繼檢測(cè)到PCV3，甚至泰國(guó)早在2006年就已經(jīng)存在PCV3的感染[21].

表1 全球PCV3統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表2 全球PCV3亞型數(shù)量表

本研究將從華北地區(qū)采集的病料作為陽(yáng)性模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增其全基因組序列，獲得1株新PCV3毒株.利用DNA Star和MEGA-X軟件對(duì)河北省Cap蛋白，全球PCV3全基因組序列進(jìn)行了核苷酸同源型和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析，以了解該病毒的序列特征、遺傳進(jìn)化和流行情況，為防治豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)提供理論依據(jù).

本研究將GenBank上已發(fā)表的所有河北省PCV3 Cap蛋白進(jìn)行了核苷酸同源性及遺傳進(jìn)化樹(shù)分析，其同源性在98.7%～99.1%，親緣關(guān)系較近，且所獲得的PCV3河北株為3b亞型.Cap蛋白是由ORF2編碼的與病毒結(jié)構(gòu)有關(guān)的蛋白，其在5′端包含一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且其含有214個(gè)氨基酸殘基，比PCV2 Cap蛋白少19～20個(gè)氨基酸殘基，目前對(duì)PCV3了解較少，需要進(jìn)一步深入研究.

此外，本研究將GenBank上已發(fā)表的全部國(guó)內(nèi)外175株(包含所獲得的PCV3河北株)PCV3的全基因組序列進(jìn)行核苷酸同源性及遺傳進(jìn)化樹(shù)分析，其同源性在98.7%～99.3%，沒(méi)有產(chǎn)生明顯的變異，且由全球PCV3全基因組基因進(jìn)化樹(shù)中可以初步推斷PCV3及其亞型的分布與地域有關(guān)，PCV3亞型的分布在北方、歐洲、國(guó)外和全球存在差異，而這僅僅是基于GenBank上現(xiàn)有的全部基因序列分析得出的結(jié)果，更加準(zhǔn)確的結(jié)論需要大量的數(shù)據(jù)進(jìn)行更進(jìn)一步的分析.

4 結(jié)論

發(fā)現(xiàn)了一株新PCV3毒株(GenBank登錄號(hào)：MK105924)，與河北省PCV3 Cap蛋白親緣關(guān)系較近，且所獲得的PCV3河北株為3b亞型，通過(guò)對(duì)全球PCV3全基因組進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析， PCV3亞型的分布與地域有關(guān).