李志，李琳，石曉峰，范彬

(1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

牡丹(Paeoniasuffrutcosa)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan)多年生落葉灌木，別名鹿韭，鼠姑[1]，是一種重要的觀賞藥用植物.牡丹在我國已有2000 多年的藥用歷史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，在歷版《中華人民共和國藥典》中均有收載，具有清熱涼血、活血化瘀的功能[2]，其花、籽、根、花粉、葉亦均有很高的食藥價值和經(jīng)濟(jì)價值[3].牡丹花粉是牡丹花雄蕊上的孢子，其粗蛋白含量為38.85%，人體必須氨基酸總含量達(dá)130.6 mg/g[4]；含18種脂肪酸，不飽和脂肪酸占脂肪酸總量的50.45%～73.55%[5]；還含有水溶性糖、半纖維素、果膠、維生素、微量元素以及其他天然活性物質(zhì)，包括酶、黃酮類化合物、激素、核酸和有機(jī)酸等[6-8].目前，牡丹花粉已被開發(fā)成口服液[9]，以及作為保健面條、酸奶、啤酒等的原料[10-12]，但迄今未見相關(guān)產(chǎn)品上市，究其原因可能是牡丹花粉尚未列入新食品資源.為了牡丹花粉的開發(fā)利用，本研究在牡丹花粉新食品資源研究申報的同時，以破壁的牡丹花粉為原料，采用濕法制粒壓片，通過考察口含片的外觀、口感、硬度、崩解時限，確定牡丹花粉口含片的最佳處方和制備工藝，并通過測定其模擬體內(nèi)消化產(chǎn)物對DPPH·和ABTS·的清除能力，評價牡丹花粉口含片的抗氧化能力，以期為牡丹花粉的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 LWF6-TBI低溫細(xì)胞壁破壁超微粉粹機(jī)(濟(jì)南龍威制藥設(shè)備有限公司)；YK160 搖擺式顆粒機(jī)(上海天祥健臺制藥機(jī)械有限公司)；TDP-1.5型單沖壓片機(jī)(上海綠翊機(jī)械制造有限公司)；YD-20KZ片劑硬度儀(天大天發(fā)科技有限公司)；ZB-ID智能崩解儀(天河醫(yī)療儀器有限公司)；AE260 型萬分之一電子天平(瑞士Mettle Toledo公司)；UV-1800型紫外可見分光光度計(日本島津公司);SHZ-82恒溫震蕩器(常州國華電器公司).

1.1.2 材料與試劑 牡丹花粉于2015年5月采自蘭州新區(qū)中川牡丹園，其原植物經(jīng)蘭州牡丹園藝開發(fā)公司趙潛龍高級工程師鑒定為Paeoniarockii(S.G.Haw et L.A.Lauener)T.Hong et J.J.Li.

甘露醇(青島明月海藻集團(tuán)有限公司)；乳糖(鎮(zhèn)江市富康生物工程有限公司)；阿斯巴甜(江蘇漢光甜味劑有限公司)；檸檬酸(西安化學(xué)試劑廠)；硬脂酸鎂(安徽山河藥用輔料有限公司)；DPPH·、ABTS·以及膽酸鈉均購自美國Sigma公司，抗壞血酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；α-淀粉酶(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；胃蛋白酶()；胰蛋白酶(上海中秦化學(xué)試劑有限公司)；95%乙醇(寧波萬隆食用酒精有限公司)；其它試劑均為分析純.

1.2 研究方法

1.2.1 牡丹花粉的破壁

1.2.1.1 破壁率的測定 稱取等量的破壁前后的牡丹花粉，分別加等量蒸餾水使成混懸液，攪拌均勻，制片，在電子顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，記錄花粉總數(shù)和完整花粉數(shù)，按公式：破壁率(%)=花粉總數(shù)-完整花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%，計算牡丹花粉的破壁率.

1.2.1.2 牡丹花粉的破壁工藝 將牡丹花粉均勻鋪在白色瓷盤上面，厚度不超過0.5 cm，蓋上一塊白布，置于日光充足地方曬干或低溫烘干，直至花粉中水分降至5%以下，過120目篩除雜，得到精選的牡丹花粉；然后將其裝入低溫細(xì)胞壁破壁超微粉碎機(jī)料斗中，啟動儀器粉碎20～25 min，取出，輻照滅菌，測定其破壁率，即得破壁牡丹花粉成品.

1.2.2 單因素試驗 依據(jù)濕法制粒的特點和藥物的性質(zhì)，參考文獻(xiàn)方法[13-15]，選取多種藥用輔料的不同配比進(jìn)行制粒和壓片，根據(jù)試驗結(jié)果，選擇甘露醇-乳糖為填充劑，阿斯巴甜-檸檬酸為矯味劑，乙醇為潤濕劑，硬脂酸鎂為潤滑劑，以口含片的外觀、口感、硬度、崩解時限為考察指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗篩選原輔料的配比.

1.2.2.1 評價指標(biāo) 將6片口含片放置燈光下以肉眼進(jìn)行外觀觀察，根據(jù)口含片表面的光潔程度和色澤給予評分；招募志愿者10名采用雙盲法口嘗，根據(jù)口感酸甜程度給予評分；取6片口含片，利用片劑硬度儀測定硬度，取其平均值，按硬度值的大小范圍給予評分；根據(jù)2015版中國藥典四部通則[0921]項下崩解時限檢查法，取6片口含片置于吊籃中，調(diào)節(jié)水溫為(37±1) ℃，啟動崩解儀并記錄含片完全崩解的時間，取其平均值，按崩解時限的大小范圍給予評分.具體指標(biāo)及評分標(biāo)準(zhǔn)見表1.

表1 牡丹花粉口含片的評分標(biāo)準(zhǔn)

每個指標(biāo)最高分值為9分，總分36分.

1.2.2.2 牡丹花粉口含片的制備 稱取適量過80 目篩的牡丹花粉、甘露醇-乳糖和阿斯巴甜-檸檬酸，花粉+輔料=100%，混合均勻后，加入一定質(zhì)量濃度的乙醇，經(jīng)濕法制軟材，過18目篩，制得顆粒，于50 ℃烘干后，經(jīng)30 目篩整粒，制成干顆粒，加入適量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓片，即得.

1.2.2.3 花粉用量的考察 固定阿斯巴甜-檸檬酸(1∶1)的用量為13%，考察花粉的用量，甘露醇-乳糖(1∶2)的用量隨牡丹花粉用量(34%、30%、26%、22%、18%)的變化而變化，原輔料混合均勻后，按“1.2.2.2”項下操作，以70%乙醇為潤濕劑、1%硬脂酸鎂為潤滑劑，制得牡丹花粉口含片，對其外觀、口感、硬度、崩解時限進(jìn)行評價.

1.2.2.4 填充劑甘露醇-乳糖比例的考察 固定花粉用量為22%、阿斯巴甜-檸檬酸(1∶1)的用量為13%，對用量為65%的甘露醇-乳糖的配比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)進(jìn)行篩選，原輔料混合均勻后，按“1.2.2.2”項下操作，以70%乙醇為潤濕劑、2%硬脂酸鎂為潤滑劑，制得牡丹花粉口含片，對其外觀、口感、硬度、崩解時限進(jìn)行評價.

1.2.2.5 矯味劑阿斯巴甜-檸檬酸用量的考察 固定花粉用量22%，考察矯味劑的用量，矯味劑甘露醇-乳糖(1∶2)用量隨阿斯巴甜-檸檬酸(1∶1)的用量(5%、7%、9%、11%、13%)的變化而變化，原輔料混合均勻后，按“1.2.2.2”項下操作，以70%乙醇為潤濕劑、2%硬脂酸鎂為潤滑劑，制得牡丹花粉口含片，對其外觀、口感、硬度、崩解時限進(jìn)行評價.

1.2.2.6 矯味劑阿斯巴甜-檸檬酸比例的考察 固定花粉用量為22%、甘露醇-乳糖(1∶2)的用量為67%，對用量為11%的阿斯巴甜-檸檬酸的比例(2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)進(jìn)行篩選，原輔料混合均勻后，按“1.2.2.2”項下操作，以70%乙醇為潤濕劑、2%硬脂酸鎂為潤滑劑，制得牡丹花粉口含片，對其外觀、口感、硬度、崩解時限進(jìn)行評價.

1.2.2.7 潤濕劑乙醇濃度的考察 固定花粉用量為22%、甘露醇-乳糖(1∶2)的用量為67%、阿斯巴甜-檸檬酸(1∶2)的用量為11%，原輔料混合均勻后，加入不同質(zhì)量濃度的乙醇(65%、70%、75%、80%、85%)，經(jīng)濕法制軟材，按“1.2.2.2”操作制得牡丹花粉口含片，對其外觀、口感、硬度、崩解時限進(jìn)行評價.

1.2.2.8 潤滑劑硬脂酸鎂用量的考察 固定花粉用量為22%、甘露醇-乳糖(1∶2)的用量為67%、阿斯巴甜-檸檬酸(1∶2)的用量為11%，原輔料混合均勻后，加入70%乙醇經(jīng)濕法制軟材，按“1.2.2.2”操作制得干顆粒，加入不同比例(1%、1.5%、2%、2.5%、3%)的硬脂酸鎂，混合均勻，測定休止角，壓片，對其外觀進(jìn)行評價.

1.2.3 正交試驗 在單因素試驗的結(jié)果上，采用正交試驗L9(34)設(shè)計，對影響制劑品質(zhì)的花粉用量、矯味劑比例和影響制粒質(zhì)量的乙醇濃度進(jìn)行優(yōu)選，評價指標(biāo)參照文獻(xiàn)[16]設(shè)置的“權(quán)重系數(shù)”，按公式：綜合總分=外觀評分×0.2+口感評分×0.3+硬度評分×0.2+崩解時限評分×0.3進(jìn)行計算.

1.2.4 驗證試驗 按最佳處方配比和工藝制備3批口含片，對其外觀、硬度、崩解時限和重量差異進(jìn)行評價，驗證工藝的合理性.

1.2.5 牡丹花粉口含片的抗氧化活性試驗

1.2.5.1 模擬體內(nèi)消化樣品的制備 模擬唾液的配制[17]：分別稱取0.238 g Na2HPO4、0.019 g KH2PO4以及0.8 g NaCl ，加純凈水溶解，用0.1 mol/L的鹽酸溶液將pH值調(diào)至6.75，加入5 g α-淀粉酶混勻使溶液的酶活力達(dá)到200 U/mL，置于100 mL棕色容量瓶中定容，即得.

表2 因素水平表

模擬胃液的配制[18]：稱取0.2 g NaCl用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解，并用純凈水將pH值調(diào)至1.2，加入0.32 g胃蛋白酶混勻使溶液的酶活力達(dá)到2 000 U/mL，即得.

模擬腸液的配制：稱取1.36 g KH2PO4加純凈水溶解，并用0.1 mol U/mL NaOH溶液將pH值調(diào)至6.8，加入0.05 g胰蛋白酶和2.50 g膽酸鈉混勻，使溶液的酶活力達(dá)到75 U/mL.

1.2.5.2 模擬人體消化的樣品制備[19-20]取牡丹花粉口含片研缽研細(xì)，精密稱定2 g，3 份，置于錐形瓶中，分別加入模擬唾液、模擬胃液和模擬腸液各25 mL，以封口膜封口，置于搖床上，在37 ℃、180 r/min條件下，模擬唾液樣品孵育10 min、模擬胃液和模擬腸液各孵育2 h，然后分別置于沸水浴滅酶10 min，快速冷卻，加入25 mL無水乙醇，離心15 min(4 000 r/min)，取上清液以純凈水定容至50 mL容量瓶中，即得模擬唾液、模擬胃液和模擬腸液各自的消化樣品.

另精密稱取牡丹花粉口含片粉末2 g，置于錐形瓶中，加入25 mL模擬唾液，以封口膜封口，置于搖床上，在37 ℃、180 r/min條件下孵育10 min后，用5 mol/L鹽酸溶液將pH值迅速調(diào)至1.2，加入0.08 g胃蛋白酶，以同樣條件繼續(xù)孵育2 h后，用1 mol/L NaOH溶液將pH值迅速調(diào)至6.8，加入0.0125 g胰蛋白酶和0.625 g膽酸鈉，以同樣條件繼續(xù)孵育2 h，消化完畢后，置于沸水浴中滅酶10 min，快速冷卻，加入25 mL無水乙醇，離心15 min(4 000 r/min)，取上清液以純凈水定容至50 mL容量瓶中，即得累加消化樣品.

1.2.5.3 抗氧化活性測定[21-23]將各模擬消化樣品及對照品Vc溶液分別稀釋成系列濃度2、4、6、8、10、12 mg/mL溶液，分別精密吸取上述系列濃度溶液各1 mL，分別置于10 mL比色管中，各加入0.2 mmol/L的DPPH·溶液2 mL，再加入純凈水2 mL，搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min后，于517 nm處測定吸光度值A(chǔ)1，同時以無水乙醇為參比測定DPPH·空白溶液吸光度值A(chǔ)0，按公式DPPH·清除率(%)=(A0-A1)/A0×100% ，計算各消化樣品的DPPH·清除率，以牡丹花粉口含片各模擬消化樣品質(zhì)量濃度(X，mg/mL)對DPPH·清除率(Y，%)進(jìn)行回歸，得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和IC50.

將各模擬消化樣品及對照品VC溶液稀釋成系列濃度0.1、1、2、3、4、5 mg/mL溶液.分別精密吸取上述系列濃度溶液各1 mL，分別置于10 mL比色管中，各加入ABTS工作液(將35 mol/L的ABTS溶液和25 mol/L的過硫酸鉀溶液按2∶1的體積比混勻，用無水乙醇稀釋至吸光度為0.6±0.1)3 mL，再加入純凈水1 mL，搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min后，于734 nm處測定吸光度值A(chǔ)1，同時以水為參比測定ABTS·空白溶液吸光度值A(chǔ)0，按公式ABTS·清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%，計算各消化樣品的ABTS·清除率，以牡丹花粉口含片各模擬消化樣品質(zhì)量濃度(X，mg/mL)對ABTS·清除率(Y，%)進(jìn)行回歸，得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和IC50.

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹花粉的破壁率

牡丹花粉近低溫細(xì)胞壁破壁超微粉碎機(jī)破壁后，其破壁率>97%.

2.2 單因素試驗

2.2.1 花粉用量對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響 由圖1可見，當(dāng)花粉的用量為22%時，口含片外觀表面光滑、色澤均勻，硬度適中，崩解時限最優(yōu)，故暫定牡丹花粉口含片的花粉用量為22%.

圖1 花粉用量對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響Figure 1 Effect of pollen dosage on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.2 甘露醇-乳糖的比例對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響 由圖2可見，隨著乳糖比例的逐漸增大，牡丹花粉口含片的硬度和崩解時限明顯增大，當(dāng)甘露醇-乳糖比例為1∶2時，牡丹花粉口含片的外觀、口感最佳，硬度和崩解時限符合藥典要求，故將填充劑甘露醇-乳糖的比例定為1∶2.

圖2 甘露醇-乳糖比例對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響Figure 2 Effect of mannitol-lactose proportion on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.3 矯味劑用量對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響 由圖3可見，隨矯味劑阿斯巴甜-檸檬酸用量的增大，牡丹花粉口含片的各項指標(biāo)均增大，當(dāng)矯味劑用量為11%和13%時，其口含片的外觀均表面光滑、色澤均勻，雖然矯味劑用量為13%時口含片的硬度和崩解時限最優(yōu)，當(dāng)考慮到矯味劑用量為11%時口含片的口感最佳，故暫定矯味劑用量為11%.

圖3 矯味劑用量對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響Figure 3 Effect of corrigent dosage on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.4 阿斯巴甜-檸檬酸的比例對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響 由圖4可見，當(dāng)阿斯巴甜-檸檬酸的比例為1∶1～1∶3時，牡丹花粉口含片的外觀均表面光滑、色澤均勻，硬度相當(dāng)，當(dāng)阿斯巴甜-檸檬酸比例為1∶2時，牡丹花粉口含片口感最佳、崩解時限最優(yōu)，故確定矯味劑阿斯巴甜-檸檬酸的比例為1∶2.

圖4 矯味劑比例對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響Figure 4 Effect of aspartame-citric acid proportion on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.5 乙醇濃度對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響 由圖5可見，當(dāng)乙醇濃度為65%～75%時，牡丹花粉口含片的外觀、硬度均較佳，以70%乙醇的崩解時限最優(yōu)；當(dāng)乙醇濃度超過75%時，牡丹花口含片的硬度下降出現(xiàn)松片裂片現(xiàn)象.綜合考慮選擇70%乙醇為潤濕劑.

圖5 乙醇濃度對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響Figure 5 Effect of ethanol concentration on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.6 硬脂酸鎂對顆粒流動性和壓片效果的影響 由表3可見，當(dāng)硬脂酸鎂用量為1.5%時顆粒的流動性和口含片的外觀最好，故確定硬脂酸鎂用量為1.5%.

2.3 正交試驗

正交試驗結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5.由正交實驗的結(jié)果可知，影響牡丹花粉口含片綜合評分的因素依次為：A>B>C，即花粉用量>矯味劑比例>潤濕劑；方差分析結(jié)果表明，花粉用量和矯味劑比例對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響具有顯著性意義(P<0.05)；最優(yōu)水平組合為A3B2C2，即花粉用量為22%，矯味劑比例為1∶1.5，潤濕劑為70%乙醇.

表3 硬脂酸鎂對顆粒流動性和可壓性的影響

表4 正交試驗結(jié)果

表5 方差分析結(jié)果

F0.05(2,2)=19.000.

2.4 驗證試驗

根據(jù)單因素試驗和正交試驗優(yōu)選得到的處方和工藝為牡丹花粉22%、甘露醇-乳糖(1∶2)67%、阿斯巴甜-檸檬酸(1∶1.5) 11%，混合均勻，用70% 乙醇濕法制粒，烘干，整粒，加入1.5% 硬脂酸鎂，壓片，即得.按上述最佳處方配比和工藝制備了3批口含片進(jìn)行驗證，觀察到口含片外表光潔、色澤均勻；3批牡丹花粉口含片的硬度控制在37.8～48.3 N，崩解時限為11.30 min左右，平均片質(zhì)量為0.400 6 g，質(zhì)量差異小于±5%，結(jié)果見表6.以上結(jié)果均符合藥典規(guī)定.表明優(yōu)選的處方及工藝穩(wěn)定可靠，合理可行.

表6 驗證試驗結(jié)果

2.5 牡丹花粉口含片的抗氧化活性

2.5.1 模擬消化樣品清除DPPH·的能力 由圖6可見，牡丹花粉口含片各模擬消化樣品均表現(xiàn)出一定的清除DPPH·的活性.由表7可知，各模擬消化樣品在質(zhì)量濃度2～12 mg/mL范圍內(nèi)與DPPH·的清除率呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.966 7～0.995 5；牡丹花粉口含片不同消化樣品對DPPH·的IC50依次為腸液消化樣品>唾液消化樣品>胃液消化樣品，提示抗DPPH·活性成分主要在腸液和唾液消化，其累加消化樣品對DPPH·清除率的IC50為(4.722±0.112)mg/mL.

2.5.2 模擬消化產(chǎn)物清除ABTS·的能力 由圖7可見，牡丹花粉口含片各模擬消化樣品均表現(xiàn)出一定的清除ABTS·活性.由表8可知，各模擬消化樣品在質(zhì)量濃度0.1～3 mg/mL范圍內(nèi)與ABTS·清除率呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.984 4～0.989 7；牡丹花粉口含片不同消化樣品對ABTS·的的半數(shù)清除率率IC50依次為胃液消化樣品>腸液消化樣品>唾液消化樣品，提示抗ABTS·活性成分主要在胃液消化，其累加消化樣品對DPPH自由基清除率的IC50為(0.540±0.048) mg/mL.

表7 模擬消化樣品對DPPH自由基的清除率的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和半數(shù)清除率

表8 模擬消化樣品對ABTS自由基的清除率的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和半數(shù)清除率

圖6 模擬消化樣品及VC對DPPH自由基的清除能力Figure 6 DPPH free radical scavenging activity of simulation digestion samples and VC

圖7 模擬消化樣品及VC對ABTS自由基的清除能力Figure 7 ABTS free radical scavenging activity of simulation digestion samples and VC

3 結(jié)論

1) 本試驗通過單因素和正交試驗確定的牡丹花粉口含片的最佳處方和制備工藝為牡丹花粉用量22%，甘露醇-乳糖(1∶2)用量為67%，阿斯巴甜-檸檬酸(1∶1.5)用量為11%，原輔料混合均勻，加入70%乙醇經(jīng)濕法制軟材，過18目篩，制得顆粒，于50 ℃烘干后，經(jīng)30 目篩整粒，制成干顆粒，加入1.5%硬脂酸鎂，混合均勻，壓片.該工藝經(jīng)驗證，制得的口含片均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，表明該工藝穩(wěn)定可行，操作簡便，適合于工業(yè)化生產(chǎn).

2) 本試驗通過測定牡丹花粉口含片模擬體內(nèi)消化產(chǎn)物對DPPH和ABTS自由基的清除能力，評價牡丹花粉口含片抗氧化活性.結(jié)果顯示，腸液消化樣品對DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)，而胃液消化樣品對ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)，累加消化液對DPPH、ABTS自由基的半數(shù)清除率(IC50)分別為(4.722±0.112)(0.540±0.048) mg/mL.