趙藝璇，呂昊卓，孫桂芳，劉易超，4，劉冬云

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與旅游學(xué)院，河北 保定 071000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.興隆縣住房和城鄉(xiāng)建設(shè)局，河北 承德 067300；4.河北潤(rùn)豐林業(yè)科技有限公司，河北 石家莊 050000)

三月花葵(Lavateratrimestris)又稱(chēng)裂葉花葵，錦葵科花葵屬植物，一年生草本[1].三月花葵半耐寒，喜陽(yáng)光充足，涼爽濕潤(rùn)的環(huán)境，可做盆栽，切花，也可用于花鏡及花壇，管理簡(jiǎn)易，是優(yōu)良的園林綠化材料[2].目前，國(guó)內(nèi)對(duì)花葵屬植物研究較少，僅關(guān)雪蓮研究了歐亞花葵種子萌發(fā)特性[3]，楊體強(qiáng)研究了鹽脅迫下電場(chǎng)處理對(duì)花葵種子發(fā)芽率的影響[4].染色體的數(shù)目和形態(tài)是植物最穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征之一，研究和比較物種核型有助于分析判斷物種間的親緣關(guān)系，是探究種群間發(fā)育與演化的重要依據(jù)之一[5].前人對(duì)鐵線蓮[6]，雪菊[7]，德國(guó)鳶尾[8]，木薯[9]等植物進(jìn)行過(guò)染色體核型分析，結(jié)果表明這些植物在物種性和親緣關(guān)系存在一致性.齊宇晴對(duì)三月花葵染色體進(jìn)行了研究，結(jié)果表明三月花葵染色體條數(shù)2n=14，核型公式為2n=14=6m+8sm，核型為“2A”型[10].本文采用常規(guī)壓片法對(duì)7個(gè)品種三月花葵染色體進(jìn)行核型分析，通過(guò)研究7個(gè)品種三月花葵染色體的數(shù)目和形態(tài)、種間的遺傳變異及系統(tǒng)演化，以期為三月花葵分類(lèi)、雜交育種及種質(zhì)資源鑒定提供細(xì)胞學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1. 試驗(yàn)材料

供試三月花葵見(jiàn)表1.

表1 供試三月花葵植物名錄

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 染色體制片 挑選無(wú)病蟲(chóng)害、生長(zhǎng)狀況良好的種子播種于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi).將其置于25 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行生根培養(yǎng).待根尖長(zhǎng)到0.5～1 cm時(shí)，于上午9∶00置于冰水混合物中預(yù)處理24 h，之后卡諾氏固定液(無(wú)水乙醇∶冰乙酸=3∶1)中固定24 h，若需保存?zhèn)溆?，取出后蒸餾水洗凈，置于75%酒精中.蒸餾水沖洗根尖3～4次，用1 mol/L鹽酸在65 ℃恒溫水浴鍋中水浴10 min，蒸餾水洗凈后，取根尖1 mm，滴加卡寶品紅染液染色30 min，壓實(shí)后用橡皮頭輕輕敲打至細(xì)胞松散.將壓片置于Leica DM 4000顯微鏡下觀察，每個(gè)品種至少選擇30個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察，挑選分裂中期分裂相比較好的細(xì)胞拍照[11].

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 使用LAS X、Photoshop CS6進(jìn)行圖像采集與加工，SPSS 22和Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì).染色體配對(duì)，相對(duì)長(zhǎng)度及臂比值遵循Levan等命名系統(tǒng)[12].中期染色體分析采用李懋學(xué)等[13]的標(biāo)準(zhǔn)，核型類(lèi)型采用Stebbins的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[14]，核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)采用Arano的方法進(jìn)行計(jì)算，比值越大越不對(duì)稱(chēng)[15].

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目及特征

本試驗(yàn)中7個(gè)三月花葵品種均為二倍體，未發(fā)現(xiàn)非整倍體變異和多倍現(xiàn)象，染色體數(shù)較為穩(wěn)定.7個(gè)三月花葵品種染色體基數(shù)為x=7，染色體數(shù)均為14條(2n=2x=14).

2.2 三月花葵染色體核型特征分析

三月花葵不同品種主要核型參數(shù)見(jiàn)表2～3.結(jié)果表明，三月花葵的7份樣本中，主要基本由3種染色體(m、sm、st)組成；核型包含3個(gè)類(lèi)型：2C型，3B型和3C型；核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)在60.98%～70.74%之間；最長(zhǎng)染色體/最短染色體值在3.88～5.48之間.供試三月花葵的染色體類(lèi)型主要包含m和sm類(lèi)型.PB在第6條和第7條短臂上連有隨體，MB在第6條短臂上連有隨體.三月花葵LO、DWP、SC、NO、PB、MB、THP的相長(zhǎng)度范圍分別是10.44～21.49、8.01～19.38、11.15～17.89、8.35～23.12、10.03～18.58、10.67～18.51、10.36～17.52.依據(jù)核型類(lèi)型可分為3類(lèi)：LO、DWP屬于2C型，SC和NO屬于3B型，PB、MB和THP屬于3C型，其中3C型占比例較大.此外，各品種的最長(zhǎng)與最短染色體比值范圍為3.88～5.48，臂比大于2∶1 的染色體占染色體總數(shù)的百分比范圍是29%～86%；各品種的核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)范圍為60.98%～70.74%.一般認(rèn)為核型進(jìn)化趨勢(shì)是從對(duì)稱(chēng)向不對(duì)稱(chēng)發(fā)展，本試驗(yàn)中不同品種的三月花葵的核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)范圍為60.98%～70.74%，都屬于不對(duì)稱(chēng)性較強(qiáng)的類(lèi)型，推測(cè)三月花葵的進(jìn)化程度較為進(jìn)化.

根據(jù)Stebbins核對(duì)稱(chēng)性原則[14]，可按照核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)，從高到低可以將7個(gè)不同品種排列為：‘雙胞胎熱粉’>‘勃朗峰’>‘諾維拉’>‘銀杯’>‘粉色腮紅’>‘小矮人粉暈’>‘情人’，其中‘情人’進(jìn)化程度較低，‘雙胞胎熱粉’進(jìn)化程度較高.

表2 7個(gè)三月花葵品種的核型參數(shù)

2.3 聚類(lèi)分析

以染色體長(zhǎng)度比、平均臂比和核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析[15].結(jié)果顯示(圖2)，遺傳距離為12時(shí)，三月花葵的7個(gè)品種被劃分為3類(lèi)，‘諾維拉’‘粉色腮紅’‘情人’‘雙胞胎熱粉’聚為一類(lèi)，‘銀杯’和‘小矮人粉暈’聚為一類(lèi)，而‘勃朗峰’則被單獨(dú)劃分為一類(lèi).當(dāng)遺傳距離大于12.0以后，除‘銀杯’和‘小矮人粉暈’仍然自成一類(lèi)外，其余三月花葵均聚為同一類(lèi).說(shuō)明在核型特征上‘諾維拉’‘粉色腮紅’‘情人’‘雙胞胎熱粉’‘勃朗峰’相似度高，而‘銀杯’和‘小矮人粉暈’相似度高.

圖1 三月花葵有絲分裂中期染色體形態(tài)、核型及核型模式Figure 1 Metaphase chromosomes,karyotype and idiograms of Lavatera trimetris

3 討論

染色體數(shù)目及特征是重要的生物學(xué)數(shù)據(jù)，同一物種或品種的染色體數(shù)目恒定，對(duì)闡述植物進(jìn)化程度和分類(lèi)方面具有重要意義[16].

本研究從細(xì)胞學(xué)水平對(duì)三月花葵的染色體核型進(jìn)行了研究.研究結(jié)果表明，三月花葵染色體均為2n=14條，主要由中部和近中部著絲粒染色體組成，在染色體長(zhǎng)度組成及著絲粒染色體類(lèi)型方面存在變異，類(lèi)型豐富.本試驗(yàn)中7個(gè)品種的三月花葵的染色體基數(shù)均為7，與齊宇晴等人得出的結(jié)論一致[10]，雖然在取材和品種之間有很大的差異，但其染色體數(shù)目受環(huán)境影響較小，具有很高的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性，因此可以確定三月花葵為二倍體，有14條染色體.一般來(lái)說(shuō)，在真核生物同源染色體中，至少存在一對(duì)隨體，無(wú)隨體的細(xì)胞無(wú)法生存下去[17].但在實(shí)際試驗(yàn)中，許多植物無(wú)隨體，而且即使有隨體，隨體數(shù)目、位置各不相同.在本試驗(yàn)，7個(gè)三月花葵品種中，只有‘勃朗峰’和‘粉色腮紅’存在隨體，且隨體存在位置不同，這與孫桂芳[18]、周楊等[19]的研究結(jié)果存在一致性.核型類(lèi)型上，與之前的報(bào)道存在一定的差異[10]，認(rèn)為三月花葵的核型類(lèi)型為“2C”型，“3B”型和“3C”型，出現(xiàn)差異的原因的可能與所選用材料的品種、性狀上的差異有關(guān).

表3 7個(gè)三月花葵品種的主要核型特征

圖2 三月花葵核型聚類(lèi)圖Figure 2 The cluster of Lavatera trimestris based on karyotype

根據(jù)Stebbins理論，在生物進(jìn)化過(guò)程中，染色體核型是由對(duì)稱(chēng)性向非對(duì)稱(chēng)性演化，他認(rèn)為核型對(duì)稱(chēng)性越高的生物，其染色體變異越小，進(jìn)化程度也越低，而非對(duì)稱(chēng)性程度越高的生物，其染色體變異越大，進(jìn)化程度越高[20].前人對(duì)錦葵科的懸玲花[21]和大花秋葵[22]進(jìn)行了染色體核型分析.研究表明，這兩種植物的核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)分別為59.95%、64.50%，不對(duì)稱(chēng)系數(shù)較高，均屬于進(jìn)化程度較高的類(lèi)型.本試驗(yàn)中不同品種的三月花葵的核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)均達(dá)到60%以上，同樣屬于不對(duì)稱(chēng)性較強(qiáng)的類(lèi)型，進(jìn)化程度較高，與前人研究結(jié)果一致.劉慧民等[23]在此基礎(chǔ)上對(duì)染色體核型參數(shù)的重要性進(jìn)行排序，由大到小的順序?yàn)楹诵筒粚?duì)稱(chēng)系數(shù)、平均臂比、臂比大于2的染色體、染色體長(zhǎng)度比、核型類(lèi)型.通過(guò)比較7個(gè)不同品種三月花葵的核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)可知，‘雙胞胎熱粉’進(jìn)化程度相對(duì)較高，情人’進(jìn)化程度相對(duì)較低，其他品種進(jìn)化程度居于中間.邢世巖[24]在研究中將一些種沿染色體長(zhǎng)度比方向進(jìn)化快，一些種沿平均臂比方向進(jìn)化快的現(xiàn)象歸納為核型的“雙向進(jìn)化趨勢(shì)”，本研究中的三月花葵呈雙向進(jìn)化趨勢(shì).

本試驗(yàn)首次使用SPSS軟件對(duì)7個(gè)品種三月花葵核型信息進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果表明，遺傳距離為12時(shí)，三月花葵的7個(gè)品種被劃分為3類(lèi)，‘諾維拉’‘粉色腮紅’‘情人’‘雙胞胎熱粉’聚為一類(lèi)，‘銀杯’和‘小矮人粉暈’聚為一類(lèi)，而‘勃朗峰’則被單獨(dú)劃分為一類(lèi).核型參數(shù)作為細(xì)胞學(xué)依據(jù)，具有簡(jiǎn)單易操作的優(yōu)勢(shì)，可以為三月花葵的品種分類(lèi)、親緣關(guān)系鑒定可以提供一定的理論依據(jù)，但要證實(shí)以上結(jié)論，還應(yīng)結(jié)合分子生物學(xué)手段進(jìn)行進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，三月花葵染色體均為2n=14條，三月花葵的7份樣本中，主要包括2種染色體(m，sm)，同時(shí)出現(xiàn)了st型染色體，基本由3種染色體(m、sm、st)組成；核型包含3個(gè)類(lèi)型：2C，3B和3C；核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)在60.98 %～70.74 %之間；最長(zhǎng)染色體/最短染色體值在3.88～5.48之間.根據(jù)核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)推測(cè)，三月花葵的進(jìn)化程度較為進(jìn)化，在7個(gè)三月花葵品種中，‘情人’進(jìn)化程度較低，‘雙胞胎熱粉’進(jìn)化程度較高.以染色體長(zhǎng)度比、平均臂比和核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析[24]，遺傳距離為12時(shí)，三月花葵的7個(gè)品種被劃分為3類(lèi)，‘諾維拉’‘粉色腮紅’‘情人’‘雙胞胎熱粉’聚為一類(lèi)，‘銀杯’和‘小矮人粉暈’聚為一類(lèi)，而‘勃朗峰’則被單獨(dú)劃分為一類(lèi).