龍 駒
(1 廣西欽州市婦幼保健院,2 廣西欽州市地方病細(xì)胞與分子生物學(xué)重點實驗室,欽州市 535099,電子郵箱:lab@longju.net)
地中海貧血(地貧)是一種嚴(yán)重危害人類健康的單基因遺傳病。我國南方沿海地區(qū)人群中,地貧致病基因的攜帶率較高,其中廣西人群的地貧基因攜帶率最高[1],高達(dá)25%[2]。地中海貧血的分子生物學(xué)機(jī)制為血紅蛋白珠蛋白基因簇的變異,在廣西人群中,導(dǎo)致α地貧的α珠蛋白基因簇變異在人群中的攜帶率高達(dá)17%[3]。由于重度α地貧會導(dǎo)致血紅蛋白Barts胎兒水腫綜合征,中間型α地貧會導(dǎo)致血紅蛋白H病,因此在廣西人群中,血紅蛋白Barts胎兒水腫綜合征的發(fā)生率或生育中間型α地貧基因型新生兒的概率較高,α地貧防控形勢較為嚴(yán)峻[4]。
目前,廣西已經(jīng)建成由省-市-縣區(qū)防控機(jī)構(gòu)組成的地貧三級防控體系。在各級地貧基因診斷機(jī)構(gòu)中,廣泛使用的α地貧診斷試劑的檢測范圍為4種缺失型α地貧基因(--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2)和3種非缺失型α地貧基因突變(αCSα、αQSα和αWestmeadα)。在前期的研究中,本課題組檢出了多種α地貧變異基因,其中-α21.9和-α2.4基因不在常規(guī)地貧檢測試劑檢測范圍中,但在廣西人群中的攜帶率較高[5],這反映了以往對該區(qū)域人群α地貧基因研究的不足,應(yīng)進(jìn)一步分析該區(qū)域人群的α地貧基因頻率,并重新劃定納入常規(guī)地貧基因分析的基因型范圍,以免造成漏診。欽州市婦幼保健院在北部灣沿海城市醫(yī)療行業(yè)中處于中心位置,除了本市樣本外,還有大量來自防城港市和北海市(含市轄縣)的樣本在該院進(jìn)行地貧基因檢測。因此,本研究采用同源片段相對定量法、片段分析法和常規(guī)地貧基因檢測試劑盒,分析2018~2019年欽州市婦幼保健院采集的樣本,以明確廣西南部(主要包括欽州市、防城港市、北海市)人群中α地貧基因的攜帶情況,并探討該區(qū)域常規(guī)α地貧基因檢測范圍以避免漏診。
1.1 樣本來源 樣本來源于2018~2019年欽州市婦幼保健院采集的4 000例常規(guī)地貧基因檢測樣本,其中2 900例來源自戶籍為欽州市的個體,600例來源自戶籍為防城港市的個體,500例來源自戶籍為北海市的個體。所有受檢個體均簽署知情同意書。本研究已通過欽州市婦幼保健院倫理委員會審查。
1.2 試劑和儀器 常規(guī)地貧基因檢測試劑購自益生堂生物企業(yè)有限公司(批號:20190502)和亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司(批號:A2019090006),檢測范圍包括4種缺失型α地貧基因(--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2)、3種非缺失型α地貧基因突變(αCSα、αQSα和αWestmeadα),以及17種β地貧基因突變(βCD41-42、βIVS-Ⅱ-654、βCD17、β-28、β-29、β-30、β-32、βCD26、βCD71-72、βCD43、βIVS-Ⅰ-1、β27/28、βInt M、βCD31、βCap+40-43、βCD14-15和βIVS-Ⅰ-5)。使用的檢測儀器包括3500基因分析儀(美國Life Technologies公司)、CFX96實時熒光分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、Veriti GeneAmp PCR儀(美國Life Technologies公司)等。
1.3 檢測方法 常規(guī)地貧基因檢測試劑盒嚴(yán)格按照說明書使用流程完成操作。α基因拷貝數(shù)變異檢測采用本課題組自研的基于同源片段相對定量法的定量PCR檢測體系[6];其他罕見地貧基因采用本實驗室自研的定量熒光PCR體系和測序法完成[7]。基于同源片段相對定量法的定量PCR檢測體系,其檢測目標(biāo)為α1和α2基因拷貝數(shù)變異情況,并結(jié)合常規(guī)地貧基因檢測結(jié)果初步判斷是否存在罕見地貧基因變異,再采用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)、裂口PCR、測序法等進(jìn)行驗證;定量熒光PCR體系用于快速篩查本實驗室偶有檢出的熱點α地貧基因突變,陽性結(jié)果采用測序法進(jìn)行驗證。
2.1 常規(guī)α地貧基因分析結(jié)果 在4 000例檢測樣本中,使用常規(guī)地貧基因檢測試劑盒共檢出1 713例α地貧基因陽性樣本,最主要的基因類型為缺失型地貧基因,其中以--SEA缺失最為常見。見表1。
表1 1 713例α地貧基因陽性樣本的基因型分布情況
2.2 罕見型基因篩查結(jié)果 采用同源片段相對定量法的定量PCR檢測體系以及定量熒光PCR體系,共檢出17例提示存在罕見地貧基因但常規(guī)基因分析顯示正常的樣本。經(jīng)測序、跨越斷點式PCR[1](即Gap-PCR)驗證后,這17例樣本的基因突變類型包括2.4缺失(-α2.4)、香港型(HKαα)、HBA2:c.91_93delGAG、HBA2:c.91G>C、欽州型缺失(-α21.9)、融合基因(Fusion),見表2。融合基因測序結(jié)果見圖1[8]。
表2 17例罕見型α地貧基因陽性樣本的基因型
圖1 融合基因(Fusion)的測序結(jié)果圖
2.3 綜合分析結(jié)果 在4 000例檢測樣本中,采用常規(guī)基因檢測試劑檢出1 713例陽性樣本,采用輔助方法篩查出17例陽性樣本,其中1例常規(guī)基因檢測結(jié)果為--SEA/αα的樣本確認(rèn)攜帶有-α2.4基因,實際陽性樣本應(yīng)為1 729例。1 729例陽性樣本共包含1 833個α地貧突變(部分為α地貧雙重雜合子),最常見的3種類型依次為--SEA、-α3.7和-α4.2,其余罕見地貧基因偶有檢出,見表3。
表3 1 833個α地貧突變的類型
目前,在廣西地貧三級防控體系中,地貧基因檢測實驗室所使用的通用檢測試劑盒檢測范圍一般包括4種缺失型α地貧基因(--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2)和3種非缺失型α地貧基因突變(αCSα、αQSα和αWestmeadα)。在廣西人群中,偶有研究組報告檢出罕見地貧基因,而這些基因大部分是由于血液學(xué)數(shù)據(jù)與基因型數(shù)據(jù)不匹配,進(jìn)而采用進(jìn)一步的檢測手段所測出的[8-10]。
本課題組構(gòu)建了基于同源片段相對定量法的定量PCR檢測體系,該體系選擇目標(biāo)序列的原則為尋找序列中的同源片段,確保同源片段的兩端有共同的可以用于構(gòu)建PCR體系引物端的序列,根據(jù)分子生物學(xué)序列特征構(gòu)建探針或者采用單側(cè)熒光標(biāo)記體系,使用熱啟動酶的PCR體系進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化至理論結(jié)果與實際檢測結(jié)果大致吻合為止。本研究采用常規(guī)地貧基因檢測試劑盒以及自研檢測體系,對4 000例樣本進(jìn)行α地貧基因的檢測,結(jié)果顯示,該人群攜帶的主要α地貧基因或基因突變類型為--SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αWestmeadα和αQSα,但依然檢測出罕見地貧基因突變,包括-α2.4、--THAI、HKαα、-α21.9和融合基因(Fusion)。在以往的研究中[5,8],我們多次檢出了基因型為--SEA/-α2.4和--SEA/-α21.9的血紅蛋白H病患者,也檢出了多例攜帶HKαα或--THAI基因的個體。這反映了以上4種基因的重要性。在日常地貧篩查中,血常規(guī)檢測儀器的準(zhǔn)確性是影響地貧篩查結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素,但部分個體接受地貧基因檢測時甚至沒有進(jìn)行血常規(guī)檢測而直接進(jìn)行常規(guī)地貧基因分析。未提供受測者的血常規(guī)數(shù)據(jù)、血常規(guī)檢測數(shù)據(jù)不準(zhǔn),或者靜止型地貧對血常規(guī)的影響較小,是導(dǎo)致這些α地貧基因漏檢的重要因素。
在α地貧基因分析中,--SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αWestmeadα和αQSα作為主要α地貧基因的檢測范圍已經(jīng)沿用了十幾年。近5年來,廣西質(zhì)量控制機(jī)構(gòu)意識到--THAI基因的重要性,要求防控機(jī)構(gòu)將該基因納入檢測范圍。因此,廣西的主流地貧基因檢測實驗室的α地貧基因檢測范圍大多數(shù)為--SEA、--THAI、-α3.7、-α4.2、αCSα、αWestmeadα和αQSα。而最近有研究揭示了-α2.4、HKαα、-α21.9和融合基因(Fusion)在該區(qū)域地貧基因檢測中的重要性[5,8,11],因而檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)根據(jù)自身實際情況逐步將這些基因納入常規(guī)基因檢測范圍內(nèi),尤其是-α2.4和-α21.9應(yīng)納入必檢范圍,避免這些重要基因的漏檢。