龍 駒

(1 廣西欽州市婦幼保健院，2 廣西欽州市地方病細胞與分子生物學(xué)重點實驗室，欽州市 535099，電子郵箱：lab@longju.net)

地中海貧血(地貧)是一種嚴重危害人類健康的單基因遺傳病。我國南方沿海地區(qū)人群中，地貧致病基因的攜帶率較高，其中廣西人群的地貧基因攜帶率最高[1]，高達25%[2]。地中海貧血的分子生物學(xué)機制為血紅蛋白珠蛋白基因簇的變異，在廣西人群中，導(dǎo)致α地貧的α珠蛋白基因簇變異在人群中的攜帶率高達17%[3]。由于重度α地貧會導(dǎo)致血紅蛋白Barts胎兒水腫綜合征，中間型α地貧會導(dǎo)致血紅蛋白H病，因此在廣西人群中，血紅蛋白Barts胎兒水腫綜合征的發(fā)生率或生育中間型α地貧基因型新生兒的概率較高，α地貧防控形勢較為嚴峻[4]。

目前，廣西已經(jīng)建成由省-市-縣區(qū)防控機構(gòu)組成的地貧三級防控體系。在各級地貧基因診斷機構(gòu)中，廣泛使用的α地貧診斷試劑的檢測范圍為4種缺失型α地貧基因(--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2)和3種非缺失型α地貧基因突變(αCSα、αQSα和αWestmeadα)。在前期的研究中，本課題組檢出了多種α地貧變異基因，其中-α21.9和-α2.4基因不在常規(guī)地貧檢測試劑檢測范圍中，但在廣西人群中的攜帶率較高[5]，這反映了以往對該區(qū)域人群α地貧基因研究的不足，應(yīng)進一步分析該區(qū)域人群的α地貧基因頻率，并重新劃定納入常規(guī)地貧基因分析的基因型范圍，以免造成漏診。欽州市婦幼保健院在北部灣沿海城市醫(yī)療行業(yè)中處于中心位置，除了本市樣本外，還有大量來自防城港市和北海市(含市轄縣)的樣本在該院進行地貧基因檢測。因此，本研究采用同源片段相對定量法、片段分析法和常規(guī)地貧基因檢測試劑盒，分析2018～2019年欽州市婦幼保健院采集的樣本，以明確廣西南部(主要包括欽州市、防城港市、北海市)人群中α地貧基因的攜帶情況，并探討該區(qū)域常規(guī)α地貧基因檢測范圍以避免漏診。

1 材料和方法

1.1 樣本來源 樣本來源于2018～2019年欽州市婦幼保健院采集的4 000例常規(guī)地貧基因檢測樣本，其中2 900例來源自戶籍為欽州市的個體，600例來源自戶籍為防城港市的個體，500例來源自戶籍為北海市的個體。所有受檢個體均簽署知情同意書。本研究已通過欽州市婦幼保健院倫理委員會審查。

1.2 試劑和儀器 常規(guī)地貧基因檢測試劑購自益生堂生物企業(yè)有限公司(批號：20190502)和亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司(批號：A2019090006)，檢測范圍包括4種缺失型α地貧基因(--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2)、3種非缺失型α地貧基因突變(αCSα、αQSα和αWestmeadα)，以及17種β地貧基因突變(βCD41-42、βIVS-Ⅱ-654、βCD17、β-28、β-29、β-30、β-32、βCD26、βCD71-72、βCD43、βIVS-Ⅰ-1、β27/28、βInt M、βCD31、βCap+40-43、βCD14-15和βIVS-Ⅰ-5)。使用的檢測儀器包括3500基因分析儀(美國Life Technologies公司)、CFX96實時熒光分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、Veriti GeneAmp PCR儀(美國Life Technologies公司)等。

1.3 檢測方法 常規(guī)地貧基因檢測試劑盒嚴格按照說明書使用流程完成操作。α基因拷貝數(shù)變異檢測采用本課題組自研的基于同源片段相對定量法的定量PCR檢測體系[6]；其他罕見地貧基因采用本實驗室自研的定量熒光PCR體系和測序法完成[7]?；谕雌蜗鄬Χ糠ǖ亩縋CR檢測體系，其檢測目標為α1和α2基因拷貝數(shù)變異情況，并結(jié)合常規(guī)地貧基因檢測結(jié)果初步判斷是否存在罕見地貧基因變異，再采用多重連接探針擴增技術(shù)、裂口PCR、測序法等進行驗證；定量熒光PCR體系用于快速篩查本實驗室偶有檢出的熱點α地貧基因突變，陽性結(jié)果采用測序法進行驗證。

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)α地貧基因分析結(jié)果 在4 000例檢測樣本中，使用常規(guī)地貧基因檢測試劑盒共檢出1 713例α地貧基因陽性樣本，最主要的基因類型為缺失型地貧基因，其中以--SEA缺失最為常見。見表1。

表1 1 713例α地貧基因陽性樣本的基因型分布情況

2.2 罕見型基因篩查結(jié)果 采用同源片段相對定量法的定量PCR檢測體系以及定量熒光PCR體系，共檢出17例提示存在罕見地貧基因但常規(guī)基因分析顯示正常的樣本。經(jīng)測序、跨越斷點式PCR[1](即Gap-PCR)驗證后，這17例樣本的基因突變類型包括2.4缺失(-α2.4)、香港型(HKαα)、HBA2:c.91_93delGAG、HBA2:c.91G>C、欽州型缺失(-α21.9)、融合基因(Fusion)，見表2。融合基因測序結(jié)果見圖1[8]。

表2 17例罕見型α地貧基因陽性樣本的基因型

圖1 融合基因(Fusion)的測序結(jié)果圖

2.3 綜合分析結(jié)果 在4 000例檢測樣本中，采用常規(guī)基因檢測試劑檢出1 713例陽性樣本，采用輔助方法篩查出17例陽性樣本，其中1例常規(guī)基因檢測結(jié)果為--SEA/αα的樣本確認攜帶有-α2.4基因，實際陽性樣本應(yīng)為1 729例。1 729例陽性樣本共包含1 833個α地貧突變(部分為α地貧雙重雜合子)，最常見的3種類型依次為--SEA、-α3.7和-α4.2，其余罕見地貧基因偶有檢出，見表3。

表3 1 833個α地貧突變的類型

3 討 論

目前，在廣西地貧三級防控體系中，地貧基因檢測實驗室所使用的通用檢測試劑盒檢測范圍一般包括4種缺失型α地貧基因(--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2)和3種非缺失型α地貧基因突變(αCSα、αQSα和αWestmeadα)。在廣西人群中，偶有研究組報告檢出罕見地貧基因，而這些基因大部分是由于血液學(xué)數(shù)據(jù)與基因型數(shù)據(jù)不匹配，進而采用進一步的檢測手段所測出的[8-10]。

本課題組構(gòu)建了基于同源片段相對定量法的定量PCR檢測體系，該體系選擇目標序列的原則為尋找序列中的同源片段，確保同源片段的兩端有共同的可以用于構(gòu)建PCR體系引物端的序列，根據(jù)分子生物學(xué)序列特征構(gòu)建探針或者采用單側(cè)熒光標記體系，使用熱啟動酶的PCR體系進行優(yōu)化，優(yōu)化至理論結(jié)果與實際檢測結(jié)果大致吻合為止。本研究采用常規(guī)地貧基因檢測試劑盒以及自研檢測體系，對4 000例樣本進行α地貧基因的檢測，結(jié)果顯示，該人群攜帶的主要α地貧基因或基因突變類型為--SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αWestmeadα和αQSα，但依然檢測出罕見地貧基因突變，包括-α2.4、--THAI、HKαα、-α21.9和融合基因(Fusion)。在以往的研究中[5，8]，我們多次檢出了基因型為--SEA/-α2.4和--SEA/-α21.9的血紅蛋白H病患者，也檢出了多例攜帶HKαα或--THAI基因的個體。這反映了以上4種基因的重要性。在日常地貧篩查中，血常規(guī)檢測儀器的準確性是影響地貧篩查結(jié)果準確性的重要因素，但部分個體接受地貧基因檢測時甚至沒有進行血常規(guī)檢測而直接進行常規(guī)地貧基因分析。未提供受測者的血常規(guī)數(shù)據(jù)、血常規(guī)檢測數(shù)據(jù)不準，或者靜止型地貧對血常規(guī)的影響較小，是導(dǎo)致這些α地貧基因漏檢的重要因素。

在α地貧基因分析中，--SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αWestmeadα和αQSα作為主要α地貧基因的檢測范圍已經(jīng)沿用了十幾年。近5年來，廣西質(zhì)量控制機構(gòu)意識到--THAI基因的重要性，要求防控機構(gòu)將該基因納入檢測范圍。因此，廣西的主流地貧基因檢測實驗室的α地貧基因檢測范圍大多數(shù)為--SEA、--THAI、-α3.7、-α4.2、αCSα、αWestmeadα和αQSα。而最近有研究揭示了-α2.4、HKαα、-α21.9和融合基因(Fusion)在該區(qū)域地貧基因檢測中的重要性[5，8，11]，因而檢測機構(gòu)應(yīng)根據(jù)自身實際情況逐步將這些基因納入常規(guī)基因檢測范圍內(nèi)，尤其是-α2.4和-α21.9應(yīng)納入必檢范圍，避免這些重要基因的漏檢。