郝云菲 桑國耀 徐 雋

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院1 牙周黏膜科，2 醫(yī)學檢驗中心，烏魯木齊市 830011，電子郵箱：181134151@qq.com)

慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)是一種牙菌斑微生物感染導致的炎癥性疾病,該病可以通過破壞牙周組織產(chǎn)生持續(xù)的過度免疫反應[1]。研究表明，基因位點變異在牙周炎的發(fā)病機制中扮演了重要的角色[2]。白細胞介素(interleukin,IL)-32是一種炎癥調(diào)控因子,在炎癥反應中起著關(guān)鍵作用，同時， IL-32也參與了機體免疫應答反應[3]。最近的研究顯示，IL-32基因多態(tài)性與炎癥免疫性疾病的發(fā)病密切相關(guān)，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)核性病變以及多發(fā)性硬化[4-6]。然而，目前有關(guān)IL-32基因多態(tài)性和CP遺傳易感性之間關(guān)系的研究較少見，故本研究探討IL-32基因多態(tài)性和CP易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1 月至2018年 12月于新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院就診的487例CP患者為觀察組。臨床分型輕型291例(59.8%)，重型196例(40.2%)；病變局部型227例(46.6%)，病變廣泛型260例(53.4%)。所有患者的診斷和分型均符合1999年牙周疾病分類國際研討會制定的CP診斷標準[7]。另采用隨機抽樣法選取來我院例行體檢的530例同地區(qū)的健康個體作為對照組，與觀察組的個體均無血緣關(guān)系。所有研究對象排除標準：合并全身性疾病(高血壓、糖尿病、心血管疾病、肝腎功能不全、感染性疾病、自身免疫性疾病以及腫瘤)、藥物性牙齦增生、妊娠以及因任何疾病而需長期藥物治療的患者。兩組研究對象的性別、年齡以及民族比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。本研究經(jīng)過新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均對本研究知情同意。

表1 兩組研究對象基線資料比較

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及基因型檢測：取兩組研究對象清晨空腹肘靜脈血2～5 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，于-80℃長期保存。采用改良碘化鈉法提取DNA，試劑盒購自Seebio公司(批號：XB1645)，于-80℃保存?zhèn)溆谩L-32的3個基因位點rs28372698、rs12934561以及rs11861531引物序列見表2。IL-32的PCR 擴增反應體系共20 μL，包含0.5 μL反應物、3.5 μL去離子、5 μL緩沖液，滅菌雙蒸水補足至20 μL。PCR反應條件為95℃ 10 min變性，92℃ 15 s，60℃ 1 min，共75個循環(huán)。實時熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems公司(型號：QuantStudioTM7 Flex)。采用 GeneMapper 4.5軟件進行基因分型。

表2 IL-32基因位點rs28372698、rs12934561及rs1186153引物序列

1.2.2 血清IL-32水平檢測：取1.2.1采集的血樣5 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清IL-32的表達水平(觀察組患者未接受治療)，試劑盒購自Elabscience公司 (批號：E-EL-H0216c)，嚴格按照說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗或Mann-Whitneyu檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，比較采用Kruskal-WallisH檢驗；采用Hardy-Weinberg定律檢驗兩組基因型是否符合遺傳平衡。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組IL-32基因型和等位基因頻率的比較 IL-32基因位點rs28372698的基因型為AA、AT、TT，位點rs11861531的基因型為CC、CT、TT，位點rs12934561的基因型為CC、CT、TT。兩組3個基因位點的頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(均P>0.05)。兩組IL-32基因位點rs28372698基因型分布、等位基因頻率差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。而兩組IL-32基因位點rs12934561和rs11861531的基因型、等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 兩組IL-32基因3個位點基因型和等位基因頻率比較[n(%)]

續(xù)表3

2.2 兩組之間以及不同基因型CP患者之間血清IL-32表達水平比較 觀察組血清IL-32水平為(266.8±37.9)pg/mL，高于對照組的(129.5±20.6)pg/mL(t=72.551，P<0.001)。IL-32基因位點rs28372698 AT、TT和AA基因型 CP患者之間血清IL-32 表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中AT和TT基因型CP患者血清IL-32 表達水平高于AA基因型CP患者(均P<0.05)，AT型和TT基因型CP患者血清IL-32的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 血清IL-32在IL-32基因位點rs28372698不同基因型CP患者中的表達水平(x±s，pg/mL)

注：與AA基因型 CP患者相比，#P<0.05。

3 討 論

在0.1%基因組DNA中，人類有200～300萬個單核苷酸多態(tài)性，位于非編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性可以調(diào)控基因表達，位于編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性可以改變蛋白質(zhì)序列，常常引起生物功能的改變[8]。IL-32在1992年被首次報道，其主要在激活的T細胞和自然殺傷細胞中高度表達，IL-32基因位于染色體16p13.3，包含8個外顯子和6個亞型[9]。IL-32基因多態(tài)性與眾多疾病密切相關(guān)，例如rs12934561位點內(nèi)含子的基因易感性和急性肺損傷的嚴重程度相關(guān)[10]， rs28372698位點變異和甲狀腺相關(guān)癌癥存在密切聯(lián)系，這種基因變異導致血清IL-32基因表達增加[11]，而純合子IL-32基因的rs28372698位點變異會增加胃癌的發(fā)病風險[12]。

近年來，有研究表明，單核苷酸多態(tài)性與CP密切相關(guān)[13-14]。而炎癥和免疫因素參與了CP的發(fā)病機制，并可加速CP的發(fā)展[15]，許多炎癥標記物的基因位點突變可導致CP發(fā)病，比如IL-6、IL-10以及腫瘤壞死因子[16]。有研究證實，作為促炎細胞因子和內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，IL-32 的合成可以增加上述炎癥因子的表達，同時IL-32的表達也促進各種趨化因子的合成和分泌[17]。此外，IL-32可以促進核因子κB信號通路的激活，而核因子κB信號通路可以調(diào)控炎癥相關(guān)因子基質(zhì)金屬蛋白酶2和9的高表達[18-19]。因此，IL-32基因相應位點的變異可能參與了CP的發(fā)病機制，增加了CP的易感性。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清IL-32水平高于對照組，且兩組IL-32基因位點rs28372698基因型分布、等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，這提示IL-32基因位點 rs28372698與CP發(fā)病存在聯(lián)系。此外，IL-32基因位點 rs28372698 AT、TT和AA基因型的 CP患者之間血清IL-32表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中AT和TT基因型 CP患者血清IL-32 表達水平高于AA基因型CP患者(P<0.05)，這表明CP患者IL-32基因rs28372698位點A/T的變異可能參與了CP的發(fā)病過程。

總之，CP的發(fā)病機制至今沒有完全闡明，環(huán)境、基因以及遺傳因素均參與了CP的發(fā)病。IL-32基因位點rs28372698 多態(tài)性可能增加了CP易感性，其中等位基因A/T變異或與CP的發(fā)病密切相關(guān)。