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        ABCA1、ABCC5基因單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性閉角型青光眼的關系▲

        2020-04-13 02:29:16李紅月辛曉蓉
        廣西醫(yī)學 2020年4期
        關鍵詞:等位基因青光眼多態(tài)性

        李紅月 辛曉蓉

        (1 青海仁濟醫(yī)院眼科,西寧市 810000,電子郵箱:lihongyue197802@163.com;2 青海紅十字醫(yī)院眼科,西寧市 810000)

        在我國,原發(fā)性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma,PACG)是青光眼的主要類型,其主要因瞳孔阻滯等促使房角關閉、引發(fā)眼內(nèi)壓升高而導致的[1]。研究顯示,絕大部分PACG患者具有瞳孔阻滯與房角變窄等特征[2]。目前,PACG致盲率仍呈增加趨勢[3],有關基因突變在PACG發(fā)生過程中作用的研究較多[4]。因此,需從基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)進一步分析PACG的發(fā)生及發(fā)展機制。以往研究表明PACG與多種基因突變有關,而基因SNP可參與PACG發(fā)生及發(fā)展過程[5]。三磷酸腺苷結合盒轉運子A1(adenosine triphosphate-binding cassette transporter A1,ABCA1)基因多態(tài)性與原發(fā)性開角型青光眼的易感性有關[6]。相關研究表明,三磷酸腺苷結合盒轉運子C5(adenosine triphosphate-binding cassette transporter C5,ABCC5)可在心臟、腦及眼角膜等組織中表達,并在多種疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用[7]。目前,尚未見有關藏族人群ABCA1、ABCC5基因SNP的研究報道。因此,本研究選取青海省藏族患者為研究對象,探討ABCA1、ABCC5基因SNP與PACG的關系,旨在為豐富PACG發(fā)病機制及提高診療效果提供理論依據(jù)。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料 選取2017年3月至2018年4月于青海仁濟醫(yī)院及青海紅十字醫(yī)院就診的96例PACG患者為研究組,均符合PACG診斷標準[8],且戶口登記為藏族,在青海地區(qū)居住時間≥5年。其中男性71例,女性25例,年齡為58~72(68.49±7.42)歲。另選取兩院同期收治的72例單純老年性白內(nèi)障患者為對照組,均符合老年性白內(nèi)障診斷標準[9],且戶口登記為藏族,在青海地區(qū)居住時間≥5年,其中男性47例,女性25例,年齡為56~70(66.32±11.05)歲。所有研究對象納入標準:(1)無PACG家族史;(2)未合并其他類型眼部疾;(3)對本研究知情且簽署同意書。所有研究對象排除標準:(1)合并青光眼性視神經(jīng)損傷;(2)既往有眼內(nèi)手術史;(3)患有內(nèi)分泌疾病;(4)心、肝等重要臟器嚴重損傷;(5)干眼癥。兩組患者的性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),具有可比性。

        1.2 方法

        1.2.1 主要試劑與儀器:DNA提取試劑盒購于賽泰克生物科技有限公司(批號:K368-50RXN);NanoDrop 2000C核酸檢測儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司,聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增儀(型號:T100 Thermal Cycler)、電泳儀(PowerPac系列)均購自美國Bio-Rad公司,DBT-2000凝膠成像儀購自美國Uvipro公司。

        1.2.2 血液樣本采集:所有患者均于清晨空腹狀態(tài)下采集靜脈血7 mL,置于乙二胺四乙酸抗凝試管內(nèi),于-20℃保存用于提取基因組DNA。

        1.2.3 基因分型方法:采用DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA,并應用細胞裂解及血紅素/蛋白沉淀技術純化基因組DNA。ABCA1、ABCC5基因分型均采用PCR結合限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性方法,ABCA1基因rs914545、ABCC5基因rs1401999位點單堿基延伸引物及PCR擴增引物的合成均由上海生物芯片有限公司完成。PCR反應體系共15 μL,包括10×緩沖液1.5 μL,脫氧核糖核苷三磷酸0.3 μL,氯化鎂0.9 μL,水生棲熱菌DNA聚合酶0.1 μL,引物各0.5 μL,DNA樣本1 μL,用離子水補充至15 μL。PCR反應條件為95℃ 15 min,95℃ 40 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共35個循環(huán),72℃延伸8 min。PCR擴增后,取PCR產(chǎn)物10 μL,加入2 μL 5U內(nèi)切酶Alu I、2 μL 10×酶切緩沖液和6 μL雙蒸水組成20 μL反應體系,37℃水浴酶切過夜。取PCR產(chǎn)物1.5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳,將其置于凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶,回收PCR產(chǎn)物并由上海生工生物公司進行序列測定。

        1.3 眼科參數(shù)的檢測 應用PENTACAM三維眼前節(jié)分析診斷系統(tǒng)(德國OCULUS公司)檢測前房深度、前房容積、前房夾角等[10]。應用尼德克綜合驗光儀(上海涵飛醫(yī)療器械有限公司)檢查最佳矯正視力(best corrected visual acuity,BCVA);運用非接觸眼壓計(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司,型號:Canon TX-20型)測量眼壓;采用超聲生物顯微鏡[西化儀(北京)科技有限公司,型號:MD-300L]測量中央前房深度(central anterior chamber depth,CACD);采用全自動電腦視野分析儀(德國Zeiss公司,型號:Humphery 750)檢測視野平均缺損;應用高分辨率光學相干斷層掃描儀(德國Zeiss公司,型號:CIRRUS HD-OCT 4000)測量平均視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(mean retinal nerve fiber layer,mRNFL)厚度。

        1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料用[n(%)]表示,比較采用χ2檢驗;采用Logistic回歸模型分析PACG發(fā)生的相關影響因素;采用Hardy-Weinberg定律檢驗兩組基因型是否符合遺傳平衡。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結 果

        2.1 兩組患者的眼部參數(shù)比較 研究組的前房深度、前房容積、BCVA、CACD低于對照組,而眼壓高于對照組(均P<0.05),兩組患者前房夾角、視野平均缺損、mRNFL厚度差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),見表1。

        表1 兩組患者的眼部參數(shù)比較(x±s)

        2.2 ABCA1基因rs914545位點、ABCC5基因rs1401999位點基因分型 ABCA1基因rs914545位點存在SNP(即G→T):(1)野生型GG型,兩條DNA條帶,分別為101 bp、65 bp;(2)突變雜合子GT型,兩條DNA條帶,分別為129 bp、94 bp;(3)突變純合子TT型,1條DNA條帶,為166 bp。ABCC5基因rs1401999位點存在SNP(即G→T):(1)野生型純合子CC型,1條DNA條帶,為167 bp;(2)突變雜合子CG型,兩條DNA條帶,分別為129 bp、200 bp;(3)突變純合子GG型,1條DNA條帶,為230 bp。見圖1。

        圖1 ABCA1、ABCC5基因位點PCR擴增產(chǎn)物酶切片段電泳圖

        注:1~3分別為ABCA1基因rs914545位點GG、GT、TT基因型;4~6分別為ABCC5基因rs1401999位點CC、CG、GG基因型。

        2.3 遺傳平衡檢驗 兩組ABCA1、ABCC5基因位點實際值與預測值差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),且各基因型頻率穩(wěn)定,符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。見表2及表3。

        表2 ABCA1基因rs914545位點基因型遺傳平衡檢驗[n(%)]

        表3 ABCC5基因rs1401999位點基因型遺傳平衡檢驗[n(%)]

        2.4 兩組基因型及等位基因分布比較 兩組ABCA1基因rs914545位點基因型及等位基因分布差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),其中研究組TT基因型頻率高于對照組,T等位基因頻率高于對照組(均P<0.05)。兩組ABCC5基因rs1401999位點基因型及等位基因分布差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),其中研究組GG基因型頻率高于對照組,G等位基因頻率高于對照組(均P<0.05)。見表4及表5。

        表4 兩組ABCA1基因rs914545位點基因型及等位基因分布[n(%)]

        表5 兩組ABCC5基因rs1401999位點基因型及等位基因分布[n(%)]

        2.5 PACG發(fā)病相關影響因素 將是否發(fā)生原發(fā)性閉角型青光眼作為因變量(0=不發(fā)生,1=發(fā)生),校正前房深度、前房容積、BCVA、眼壓、CACD等混雜因素后,以ABCA1三種基因型GG型、GT型、TT型,ABCC5三種基因型CC型、CG型、GG型作為自變量進行Logistic回歸分析,結果顯示ABCA1基因rs914545位點TT基因型、ABCC5基因rs141999位點GG基因型均為PACG發(fā)生的危險因素(均P<0.05)。見表6。

        表6 PACG發(fā)病影響因素Logistic回歸分析

        3 討 論

        青光眼是一種通過損傷視神經(jīng)及其通路進而降低視覺功能的綜合征,分為原發(fā)性、繼發(fā)性與先天性青光眼,根據(jù)房角解剖結構的不同將原發(fā)性青光眼分為PACG與原發(fā)性開角型青光眼。PACG發(fā)病原因較為復雜,且具有較高的致盲率,這是由于虹膜后方壓力增高導致虹膜向前膨隆,阻塞小梁網(wǎng)并阻止房水流出,繼而引發(fā)眼壓增高導致患者視神經(jīng)受損[11]。越來越多的研究表明,遺傳因素在PACG發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[12]。研究顯示,肌纖蛋白基因突變可導致青少年開角型青光眼的發(fā)生,同時肌纖蛋白基因rs183532位點SNP可增加原發(fā)性開角型青光眼的發(fā)病風險[13]。有學者發(fā)現(xiàn),潛伏轉化生長因子β結合蛋白2的基因多態(tài)性與PACG發(fā)病密切相關[14]。目前針對PACG的遺傳學研究不夠深入,不同種族、地域的人群研究結果不盡相同。

        ABCA1是一種整合的膜蛋白,可促使胞內(nèi)磷脂與游離膽固醇在細胞內(nèi)外流入、流出,同時游離膽固醇還可與細胞表面載脂蛋白A-I結合進而促使高密度脂蛋白的形成[15]。Zhao等[16]的研究表明ABCA1基因突變可導致載脂蛋白、多種代謝酶活性及脂蛋白發(fā)生改變,對膽固醇逆轉運過程產(chǎn)生重要影響,最終導致脂代謝紊亂。相關研究表明,ABCA1基因rs914545位點SNP可增加機體血脂水平升高及冠心病的發(fā)生風險[17]。蔡暉等[18]的研究表明ABCA1基因rs914545位點SNP與漢族人群原發(fā)性開角型青光眼易感性有關。關于ABCA1基因rs914545位點SNP與藏族人群PACG發(fā)病風險關系,尚未見研究報道。本研究結果顯示,ABCA1基因rs914545位點存在SNP,為G→T,即TT為突變純合子。研究組ABCA1基因rs914545位點TT基因型及T等位基因頻率高于對照組(P<0.05),這提示ABCA1基因rs914545位點SNP可能與PACG發(fā)生相關。

        ABCC5又稱為多藥耐藥性蛋白5(multidrug resistance-associated protein 5,MRP5),其可通過抗癌藥物等參與細胞信號轉導過程[19]。相關研究表明,ABCC5主要在角膜、視網(wǎng)膜色素上皮細胞中表達,還可在虹膜、睫狀體及晶體中表達,但參與細胞信號轉導的具體作用機制尚未完全闡明[20]。同時ABCC5 mRNA表達還與老年性黃斑病變的發(fā)生及發(fā)展密切相關[21]。桑景葒等[22]通過統(tǒng)計反演及模擬演算對PACG患者易感基因位點進行檢測,發(fā)現(xiàn)ABCC5基因多態(tài)性與PACG發(fā)病有關。但有關ABCC5基因rs1401999位點突變與PACG發(fā)病之間關系的研究相對較少。本研究結果顯示,ABCC5基因rs1401999位點存在SNP,為C→G,即GG為突變純合子。研究組ABCC5基因rs1401999位點GG基因型及G等位基因頻率高于對照組(P<0.05),說明ABCC5基因rs1401999位點SNP可能與PACG發(fā)生相關。

        本研究進一步采用Logistic回歸模型分析PACG發(fā)病的相關影響因素,結果顯示ABCA1基因rs914545位點TT基因型、ABCC5基因rs1401999位點GG基因型均為PACG發(fā)生的危險因素(P<0.05),提示ABCA1基因rs914545位點及ABCC5基因rs1401999位點SNP與PACG發(fā)生有關。

        綜上所述,ABCA1基因rs914545位點、ABCC5基因rs1401999位點SNP與PACG發(fā)病有關,攜帶ABCA1基因rs914545位點TT基因型及ABCC5基因rs1401999位點GG基因型者發(fā)生PACG的風險更大。但本研究僅納入本地區(qū)部分藏族患者進行分析研究,而PACG是一種受多基因、地域、種族等多因素影響的疾病,ABCA1、ABCC5基因在PACG中的具體作用機制有待進一步研究。

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