李紅月 辛曉蓉

(1 青海仁濟醫(yī)院眼科，西寧市 810000，電子郵箱：lihongyue197802@163.com；2 青海紅十字醫(yī)院眼科，西寧市 810000)

在我國，原發(fā)性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma，PACG)是青光眼的主要類型，其主要因瞳孔阻滯等促使房角關閉、引發(fā)眼內(nèi)壓升高而導致的[1]。研究顯示，絕大部分PACG患者具有瞳孔阻滯與房角變窄等特征[2]。目前，PACG致盲率仍呈增加趨勢[3]，有關基因突變在PACG發(fā)生過程中作用的研究較多[4]。因此，需從基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)進一步分析PACG的發(fā)生及發(fā)展機制。以往研究表明PACG與多種基因突變有關，而基因SNP可參與PACG發(fā)生及發(fā)展過程[5]。三磷酸腺苷結合盒轉運子A1(adenosine triphosphate-binding cassette transporter A1，ABCA1)基因多態(tài)性與原發(fā)性開角型青光眼的易感性有關[6]。相關研究表明，三磷酸腺苷結合盒轉運子C5(adenosine triphosphate-binding cassette transporter C5，ABCC5)可在心臟、腦及眼角膜等組織中表達，并在多種疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用[7]。目前，尚未見有關藏族人群ABCA1、ABCC5基因SNP的研究報道。因此，本研究選取青海省藏族患者為研究對象，探討ABCA1、ABCC5基因SNP與PACG的關系，旨在為豐富PACG發(fā)病機制及提高診療效果提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年3月至2018年4月于青海仁濟醫(yī)院及青海紅十字醫(yī)院就診的96例PACG患者為研究組，均符合PACG診斷標準[8]，且戶口登記為藏族，在青海地區(qū)居住時間≥5年。其中男性71例，女性25例，年齡為58～72(68.49±7.42)歲。另選取兩院同期收治的72例單純老年性白內(nèi)障患者為對照組，均符合老年性白內(nèi)障診斷標準[9]，且戶口登記為藏族，在青海地區(qū)居住時間≥5年，其中男性47例，女性25例，年齡為56～70(66.32±11.05)歲。所有研究對象納入標準：(1)無PACG家族史；(2)未合并其他類型眼部疾；(3)對本研究知情且簽署同意書。所有研究對象排除標準：(1)合并青光眼性視神經(jīng)損傷；(2)既往有眼內(nèi)手術史；(3)患有內(nèi)分泌疾病；(4)心、肝等重要臟器嚴重損傷；(5)干眼癥。兩組患者的性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器：DNA提取試劑盒購于賽泰克生物科技有限公司(批號：K368-50RXN)；NanoDrop 2000C核酸檢測儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀(型號：T100 Thermal Cycler)、電泳儀(PowerPac系列)均購自美國Bio-Rad公司，DBT-2000凝膠成像儀購自美國Uvipro公司。

1.2.2 血液樣本采集：所有患者均于清晨空腹狀態(tài)下采集靜脈血7 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝試管內(nèi)，于-20℃保存用于提取基因組DNA。

1.2.3 基因分型方法：采用DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，并應用細胞裂解及血紅素/蛋白沉淀技術純化基因組DNA。ABCA1、ABCC5基因分型均采用PCR結合限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性方法，ABCA1基因rs914545、ABCC5基因rs1401999位點單堿基延伸引物及PCR擴增引物的合成均由上海生物芯片有限公司完成。PCR反應體系共15 μL，包括10×緩沖液1.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸0.3 μL，氯化鎂0.9 μL，水生棲熱菌DNA聚合酶0.1 μL，引物各0.5 μL，DNA樣本1 μL，用離子水補充至15 μL。PCR反應條件為95℃ 15 min，95℃ 40 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)，72℃延伸8 min。PCR擴增后，取PCR產(chǎn)物10 μL，加入2 μL 5U內(nèi)切酶Alu I、2 μL 10×酶切緩沖液和6 μL雙蒸水組成20 μL反應體系，37℃水浴酶切過夜。取PCR產(chǎn)物1.5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，將其置于凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶，回收PCR產(chǎn)物并由上海生工生物公司進行序列測定。

1.3 眼科參數(shù)的檢測 應用PENTACAM三維眼前節(jié)分析診斷系統(tǒng)(德國OCULUS公司)檢測前房深度、前房容積、前房夾角等[10]。應用尼德克綜合驗光儀(上海涵飛醫(yī)療器械有限公司)檢查最佳矯正視力(best corrected visual acuity，BCVA)；運用非接觸眼壓計(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司，型號：Canon TX-20型)測量眼壓；采用超聲生物顯微鏡[西化儀(北京)科技有限公司，型號：MD-300L]測量中央前房深度(central anterior chamber depth，CACD)；采用全自動電腦視野分析儀(德國Zeiss公司，型號：Humphery 750)檢測視野平均缺損；應用高分辨率光學相干斷層掃描儀(德國Zeiss公司，型號：CIRRUS HD-OCT 4000)測量平均視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(mean retinal nerve fiber layer，mRNFL)厚度。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用[n(%)]表示，比較采用χ2檢驗；采用Logistic回歸模型分析PACG發(fā)生的相關影響因素；采用Hardy-Weinberg定律檢驗兩組基因型是否符合遺傳平衡。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者的眼部參數(shù)比較 研究組的前房深度、前房容積、BCVA、CACD低于對照組，而眼壓高于對照組(均P<0.05)，兩組患者前房夾角、視野平均缺損、mRNFL厚度差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者的眼部參數(shù)比較(x±s)

2.2 ABCA1基因rs914545位點、ABCC5基因rs1401999位點基因分型 ABCA1基因rs914545位點存在SNP(即G→T)：(1)野生型GG型，兩條DNA條帶，分別為101 bp、65 bp；(2)突變雜合子GT型，兩條DNA條帶，分別為129 bp、94 bp；(3)突變純合子TT型，1條DNA條帶，為166 bp。ABCC5基因rs1401999位點存在SNP(即G→T)：(1)野生型純合子CC型，1條DNA條帶，為167 bp；(2)突變雜合子CG型，兩條DNA條帶，分別為129 bp、200 bp；(3)突變純合子GG型，1條DNA條帶，為230 bp。見圖1。

圖1 ABCA1、ABCC5基因位點PCR擴增產(chǎn)物酶切片段電泳圖

注：1～3分別為ABCA1基因rs914545位點GG、GT、TT基因型；4～6分別為ABCC5基因rs1401999位點CC、CG、GG基因型。

2.3 遺傳平衡檢驗 兩組ABCA1、ABCC5基因位點實際值與預測值差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，且各基因型頻率穩(wěn)定，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。見表2及表3。

表2 ABCA1基因rs914545位點基因型遺傳平衡檢驗[n(%)]

表3 ABCC5基因rs1401999位點基因型遺傳平衡檢驗[n(%)]

2.4 兩組基因型及等位基因分布比較 兩組ABCA1基因rs914545位點基因型及等位基因分布差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，其中研究組TT基因型頻率高于對照組，T等位基因頻率高于對照組(均P<0.05)。兩組ABCC5基因rs1401999位點基因型及等位基因分布差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，其中研究組GG基因型頻率高于對照組，G等位基因頻率高于對照組(均P<0.05)。見表4及表5。

表4 兩組ABCA1基因rs914545位點基因型及等位基因分布[n(%)]

表5 兩組ABCC5基因rs1401999位點基因型及等位基因分布[n(%)]

2.5 PACG發(fā)病相關影響因素 將是否發(fā)生原發(fā)性閉角型青光眼作為因變量(0=不發(fā)生，1=發(fā)生)，校正前房深度、前房容積、BCVA、眼壓、CACD等混雜因素后，以ABCA1三種基因型GG型、GT型、TT型，ABCC5三種基因型CC型、CG型、GG型作為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示ABCA1基因rs914545位點TT基因型、ABCC5基因rs141999位點GG基因型均為PACG發(fā)生的危險因素(均P<0.05)。見表6。

表6 PACG發(fā)病影響因素Logistic回歸分析

3 討 論

青光眼是一種通過損傷視神經(jīng)及其通路進而降低視覺功能的綜合征，分為原發(fā)性、繼發(fā)性與先天性青光眼，根據(jù)房角解剖結構的不同將原發(fā)性青光眼分為PACG與原發(fā)性開角型青光眼。PACG發(fā)病原因較為復雜，且具有較高的致盲率，這是由于虹膜后方壓力增高導致虹膜向前膨隆，阻塞小梁網(wǎng)并阻止房水流出，繼而引發(fā)眼壓增高導致患者視神經(jīng)受損[11]。越來越多的研究表明，遺傳因素在PACG發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[12]。研究顯示，肌纖蛋白基因突變可導致青少年開角型青光眼的發(fā)生，同時肌纖蛋白基因rs183532位點SNP可增加原發(fā)性開角型青光眼的發(fā)病風險[13]。有學者發(fā)現(xiàn)，潛伏轉化生長因子β結合蛋白2的基因多態(tài)性與PACG發(fā)病密切相關[14]。目前針對PACG的遺傳學研究不夠深入，不同種族、地域的人群研究結果不盡相同。

ABCA1是一種整合的膜蛋白，可促使胞內(nèi)磷脂與游離膽固醇在細胞內(nèi)外流入、流出，同時游離膽固醇還可與細胞表面載脂蛋白A-I結合進而促使高密度脂蛋白的形成[15]。Zhao等[16]的研究表明ABCA1基因突變可導致載脂蛋白、多種代謝酶活性及脂蛋白發(fā)生改變，對膽固醇逆轉運過程產(chǎn)生重要影響，最終導致脂代謝紊亂。相關研究表明，ABCA1基因rs914545位點SNP可增加機體血脂水平升高及冠心病的發(fā)生風險[17]。蔡暉等[18]的研究表明ABCA1基因rs914545位點SNP與漢族人群原發(fā)性開角型青光眼易感性有關。關于ABCA1基因rs914545位點SNP與藏族人群PACG發(fā)病風險關系，尚未見研究報道。本研究結果顯示，ABCA1基因rs914545位點存在SNP，為G→T，即TT為突變純合子。研究組ABCA1基因rs914545位點TT基因型及T等位基因頻率高于對照組(P<0.05)，這提示ABCA1基因rs914545位點SNP可能與PACG發(fā)生相關。

ABCC5又稱為多藥耐藥性蛋白5(multidrug resistance-associated protein 5，MRP5)，其可通過抗癌藥物等參與細胞信號轉導過程[19]。相關研究表明，ABCC5主要在角膜、視網(wǎng)膜色素上皮細胞中表達，還可在虹膜、睫狀體及晶體中表達，但參與細胞信號轉導的具體作用機制尚未完全闡明[20]。同時ABCC5 mRNA表達還與老年性黃斑病變的發(fā)生及發(fā)展密切相關[21]。桑景葒等[22]通過統(tǒng)計反演及模擬演算對PACG患者易感基因位點進行檢測，發(fā)現(xiàn)ABCC5基因多態(tài)性與PACG發(fā)病有關。但有關ABCC5基因rs1401999位點突變與PACG發(fā)病之間關系的研究相對較少。本研究結果顯示，ABCC5基因rs1401999位點存在SNP，為C→G，即GG為突變純合子。研究組ABCC5基因rs1401999位點GG基因型及G等位基因頻率高于對照組(P<0.05)，說明ABCC5基因rs1401999位點SNP可能與PACG發(fā)生相關。

本研究進一步采用Logistic回歸模型分析PACG發(fā)病的相關影響因素，結果顯示ABCA1基因rs914545位點TT基因型、ABCC5基因rs1401999位點GG基因型均為PACG發(fā)生的危險因素(P<0.05)，提示ABCA1基因rs914545位點及ABCC5基因rs1401999位點SNP與PACG發(fā)生有關。

綜上所述，ABCA1基因rs914545位點、ABCC5基因rs1401999位點SNP與PACG發(fā)病有關，攜帶ABCA1基因rs914545位點TT基因型及ABCC5基因rs1401999位點GG基因型者發(fā)生PACG的風險更大。但本研究僅納入本地區(qū)部分藏族患者進行分析研究，而PACG是一種受多基因、地域、種族等多因素影響的疾病，ABCA1、ABCC5基因在PACG中的具體作用機制有待進一步研究。