李紅月 辛?xí)匀?/p>

(1 青海仁濟(jì)醫(yī)院眼科，西寧市 810000，電子郵箱：lihongyue197802@163.com；2 青海紅十字醫(yī)院眼科，西寧市 810000)

在我國(guó)，原發(fā)性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma，PACG)是青光眼的主要類(lèi)型，其主要因瞳孔阻滯等促使房角關(guān)閉、引發(fā)眼內(nèi)壓升高而導(dǎo)致的[1]。研究顯示，絕大部分PACG患者具有瞳孔阻滯與房角變窄等特征[2]。目前，PACG致盲率仍呈增加趨勢(shì)[3]，有關(guān)基因突變?cè)赑ACG發(fā)生過(guò)程中作用的研究較多[4]。因此，需從基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)進(jìn)一步分析PACG的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制。以往研究表明PACG與多種基因突變有關(guān)，而基因SNP可參與PACG發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[5]。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(adenosine triphosphate-binding cassette transporter A1，ABCA1)基因多態(tài)性與原發(fā)性開(kāi)角型青光眼的易感性有關(guān)[6]。相關(guān)研究表明，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子C5(adenosine triphosphate-binding cassette transporter C5，ABCC5)可在心臟、腦及眼角膜等組織中表達(dá)，并在多種疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用[7]。目前，尚未見(jiàn)有關(guān)藏族人群ABCA1、ABCC5基因SNP的研究報(bào)道。因此，本研究選取青海省藏族患者為研究對(duì)象，探討ABCA1、ABCC5基因SNP與PACG的關(guān)系，旨在為豐富PACG發(fā)病機(jī)制及提高診療效果提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年3月至2018年4月于青海仁濟(jì)醫(yī)院及青海紅十字醫(yī)院就診的96例PACG患者為研究組，均符合PACG診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，且戶口登記為藏族，在青海地區(qū)居住時(shí)間≥5年。其中男性71例，女性25例，年齡為58～72(68.49±7.42)歲。另選取兩院同期收治的72例單純老年性白內(nèi)障患者為對(duì)照組，均符合老年性白內(nèi)障診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，且戶口登記為藏族，在青海地區(qū)居住時(shí)間≥5年，其中男性47例，女性25例，年齡為56～70(66.32±11.05)歲。所有研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無(wú)PACG家族史；(2)未合并其他類(lèi)型眼部疾；(3)對(duì)本研究知情且簽署同意書(shū)。所有研究對(duì)象排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并青光眼性視神經(jīng)損傷；(2)既往有眼內(nèi)手術(shù)史；(3)患有內(nèi)分泌疾??；(4)心、肝等重要臟器嚴(yán)重?fù)p傷；(5)干眼癥。兩組患者的性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器：DNA提取試劑盒購(gòu)于賽泰克生物科技有限公司(批號(hào)：K368-50RXN)；NanoDrop 2000C核酸檢測(cè)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀(型號(hào)：T100 Thermal Cycler)、電泳儀(PowerPac系列)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，DBT-2000凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Uvipro公司。

1.2.2 血液樣本采集：所有患者均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血7 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝試管內(nèi)，于-20℃保存用于提取基因組DNA。

1.2.3 基因分型方法：采用DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，并應(yīng)用細(xì)胞裂解及血紅素/蛋白沉淀技術(shù)純化基因組DNA。ABCA1、ABCC5基因分型均采用PCR結(jié)合限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法，ABCA1基因rs914545、ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)單堿基延伸引物及PCR擴(kuò)增引物的合成均由上海生物芯片有限公司完成。PCR反應(yīng)體系共15 μL，包括10×緩沖液1.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸0.3 μL，氯化鎂0.9 μL，水生棲熱菌DNA聚合酶0.1 μL，引物各0.5 μL，DNA樣本1 μL，用離子水補(bǔ)充至15 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃ 15 min，95℃ 40 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增后，取PCR產(chǎn)物10 μL，加入2 μL 5U內(nèi)切酶Alu I、2 μL 10×酶切緩沖液和6 μL雙蒸水組成20 μL反應(yīng)體系，37℃水浴酶切過(guò)夜。取PCR產(chǎn)物1.5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將其置于凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶，回收PCR產(chǎn)物并由上海生工生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3 眼科參數(shù)的檢測(cè) 應(yīng)用PENTACAM三維眼前節(jié)分析診斷系統(tǒng)(德國(guó)OCULUS公司)檢測(cè)前房深度、前房容積、前房夾角等[10]。應(yīng)用尼德克綜合驗(yàn)光儀(上海涵飛醫(yī)療器械有限公司)檢查最佳矯正視力(best corrected visual acuity，BCVA)；運(yùn)用非接觸眼壓計(jì)(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：Canon TX-20型)測(cè)量眼壓；采用超聲生物顯微鏡[西化儀(北京)科技有限公司，型號(hào)：MD-300L]測(cè)量中央前房深度(central anterior chamber depth，CACD)；采用全自動(dòng)電腦視野分析儀(德國(guó)Zeiss公司，型號(hào)：Humphery 750)檢測(cè)視野平均缺損；應(yīng)用高分辨率光學(xué)相干斷層掃描儀(德國(guó)Zeiss公司，型號(hào)：CIRRUS HD-OCT 4000)測(cè)量平均視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(mean retinal nerve fiber layer，mRNFL)厚度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用[n(%)]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Logistic回歸模型分析PACG發(fā)生的相關(guān)影響因素；采用Hardy-Weinberg定律檢驗(yàn)兩組基因型是否符合遺傳平衡。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者的眼部參數(shù)比較 研究組的前房深度、前房容積、BCVA、CACD低于對(duì)照組，而眼壓高于對(duì)照組(均P<0.05)，兩組患者前房夾角、視野平均缺損、mRNFL厚度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者的眼部參數(shù)比較(x±s)

2.2 ABCA1基因rs914545位點(diǎn)、ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)基因分型 ABCA1基因rs914545位點(diǎn)存在SNP(即G→T)：(1)野生型GG型，兩條DNA條帶，分別為101 bp、65 bp；(2)突變雜合子GT型，兩條DNA條帶，分別為129 bp、94 bp；(3)突變純合子TT型，1條DNA條帶，為166 bp。ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)存在SNP(即G→T)：(1)野生型純合子CC型，1條DNA條帶，為167 bp；(2)突變雜合子CG型，兩條DNA條帶，分別為129 bp、200 bp；(3)突變純合子GG型，1條DNA條帶，為230 bp。見(jiàn)圖1。

圖1 ABCA1、ABCC5基因位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切片段電泳圖

注：1～3分別為ABCA1基因rs914545位點(diǎn)GG、GT、TT基因型；4～6分別為ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)CC、CG、GG基因型。

2.3 遺傳平衡檢驗(yàn) 兩組ABCA1、ABCC5基因位點(diǎn)實(shí)際值與預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，且各基因型頻率穩(wěn)定，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。見(jiàn)表2及表3。

表2 ABCA1基因rs914545位點(diǎn)基因型遺傳平衡檢驗(yàn)[n(%)]

表3 ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)基因型遺傳平衡檢驗(yàn)[n(%)]

2.4 兩組基因型及等位基因分布比較 兩組ABCA1基因rs914545位點(diǎn)基因型及等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其中研究組TT基因型頻率高于對(duì)照組，T等位基因頻率高于對(duì)照組(均P<0.05)。兩組ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)基因型及等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其中研究組GG基因型頻率高于對(duì)照組，G等位基因頻率高于對(duì)照組(均P<0.05)。見(jiàn)表4及表5。

表4 兩組ABCA1基因rs914545位點(diǎn)基因型及等位基因分布[n(%)]

表5 兩組ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)基因型及等位基因分布[n(%)]

2.5 PACG發(fā)病相關(guān)影響因素 將是否發(fā)生原發(fā)性閉角型青光眼作為因變量(0=不發(fā)生，1=發(fā)生)，校正前房深度、前房容積、BCVA、眼壓、CACD等混雜因素后，以ABCA1三種基因型GG型、GT型、TT型，ABCC5三種基因型CC型、CG型、GG型作為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示ABCA1基因rs914545位點(diǎn)TT基因型、ABCC5基因rs141999位點(diǎn)GG基因型均為PACG發(fā)生的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 PACG發(fā)病影響因素Logistic回歸分析

3 討 論

青光眼是一種通過(guò)損傷視神經(jīng)及其通路進(jìn)而降低視覺(jué)功能的綜合征，分為原發(fā)性、繼發(fā)性與先天性青光眼，根據(jù)房角解剖結(jié)構(gòu)的不同將原發(fā)性青光眼分為PACG與原發(fā)性開(kāi)角型青光眼。PACG發(fā)病原因較為復(fù)雜，且具有較高的致盲率，這是由于虹膜后方壓力增高導(dǎo)致虹膜向前膨隆，阻塞小梁網(wǎng)并阻止房水流出，繼而引發(fā)眼壓增高導(dǎo)致患者視神經(jīng)受損[11]。越來(lái)越多的研究表明，遺傳因素在PACG發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。研究顯示，肌纖蛋白基因突變可導(dǎo)致青少年開(kāi)角型青光眼的發(fā)生，同時(shí)肌纖蛋白基因rs183532位點(diǎn)SNP可增加原發(fā)性開(kāi)角型青光眼的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，潛伏轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β結(jié)合蛋白2的基因多態(tài)性與PACG發(fā)病密切相關(guān)[14]。目前針對(duì)PACG的遺傳學(xué)研究不夠深入，不同種族、地域的人群研究結(jié)果不盡相同。

ABCA1是一種整合的膜蛋白，可促使胞內(nèi)磷脂與游離膽固醇在細(xì)胞內(nèi)外流入、流出，同時(shí)游離膽固醇還可與細(xì)胞表面載脂蛋白A-I結(jié)合進(jìn)而促使高密度脂蛋白的形成[15]。Zhao等[16]的研究表明ABCA1基因突變可導(dǎo)致載脂蛋白、多種代謝酶活性及脂蛋白發(fā)生改變，對(duì)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程產(chǎn)生重要影響，最終導(dǎo)致脂代謝紊亂。相關(guān)研究表明，ABCA1基因rs914545位點(diǎn)SNP可增加機(jī)體血脂水平升高及冠心病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[17]。蔡暉等[18]的研究表明ABCA1基因rs914545位點(diǎn)SNP與漢族人群原發(fā)性開(kāi)角型青光眼易感性有關(guān)。關(guān)于ABCA1基因rs914545位點(diǎn)SNP與藏族人群PACG發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系，尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，ABCA1基因rs914545位點(diǎn)存在SNP，為G→T，即TT為突變純合子。研究組ABCA1基因rs914545位點(diǎn)TT基因型及T等位基因頻率高于對(duì)照組(P<0.05)，這提示ABCA1基因rs914545位點(diǎn)SNP可能與PACG發(fā)生相關(guān)。

ABCC5又稱為多藥耐藥性蛋白5(multidrug resistance-associated protein 5，MRP5)，其可通過(guò)抗癌藥物等參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[19]。相關(guān)研究表明，ABCC5主要在角膜、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中表達(dá)，還可在虹膜、睫狀體及晶體中表達(dá)，但參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體作用機(jī)制尚未完全闡明[20]。同時(shí)ABCC5 mRNA表達(dá)還與老年性黃斑病變的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[21]。桑景葒等[22]通過(guò)統(tǒng)計(jì)反演及模擬演算對(duì)PACG患者易感基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ABCC5基因多態(tài)性與PACG發(fā)病有關(guān)。但有關(guān)ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)突變與PACG發(fā)病之間關(guān)系的研究相對(duì)較少。本研究結(jié)果顯示，ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)存在SNP，為C→G，即GG為突變純合子。研究組ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)GG基因型及G等位基因頻率高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)SNP可能與PACG發(fā)生相關(guān)。

本研究進(jìn)一步采用Logistic回歸模型分析PACG發(fā)病的相關(guān)影響因素，結(jié)果顯示ABCA1基因rs914545位點(diǎn)TT基因型、ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)GG基因型均為PACG發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，提示ABCA1基因rs914545位點(diǎn)及ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)SNP與PACG發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，ABCA1基因rs914545位點(diǎn)、ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)SNP與PACG發(fā)病有關(guān)，攜帶ABCA1基因rs914545位點(diǎn)TT基因型及ABCC5基因rs1401999位點(diǎn)GG基因型者發(fā)生PACG的風(fēng)險(xiǎn)更大。但本研究?jī)H納入本地區(qū)部分藏族患者進(jìn)行分析研究，而PACG是一種受多基因、地域、種族等多因素影響的疾病，ABCA1、ABCC5基因在PACG中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。