于雅潔，邱峰，張新安

研究報(bào)告

突變導(dǎo)致先天性白內(nèi)障及其在晶狀體中的表達(dá)

于雅潔1,2，邱峰3，張新安1

1. 沈陽體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，沈陽 110102 2. 遼寧省金秋醫(yī)院，沈陽 110016 3. 沈陽市第四人民醫(yī)院，沈陽市眼科醫(yī)院，沈陽 110031

先天性白內(nèi)障(congenital cataract, CC)是一種罕見的晶狀體發(fā)育異常疾病，主要表現(xiàn)為晶狀體部分或完全渾濁。先天性白內(nèi)障遺傳異質(zhì)性高，已鑒定的致病基因多達(dá)266個(gè)。本研究在一個(gè)中國先天性白內(nèi)障家系中通過全基因組測序及Sanger測序驗(yàn)證，篩查到一個(gè)新的先天性白內(nèi)障候選致病基因，與家系疾病表型共分離。通過minigene實(shí)驗(yàn)證實(shí)該變異影響基因mRNA剪接。Western blotting、免疫熒光和RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)在人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04、年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織、24周人胎眼晶狀體和小鼠晶狀體中表達(dá)。通過對iSyTE數(shù)據(jù)庫的分析發(fā)現(xiàn)，在小鼠的胚胎期和不同發(fā)育時(shí)期的晶狀體中都有表達(dá)，且在晶狀體特異性CBP:p300雙敲除小鼠中表達(dá)下調(diào)。提取在CBP:p300雙敲除小鼠晶狀體中與具有相同表達(dá)模式的一組基因進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)分析，結(jié)果表明篩選出6個(gè)基因與存在直接相互作用。GO功能分析表明Tsr1參與核糖體的組裝，還可能在MAPK-Erk信號通路中發(fā)揮作用，為進(jìn)一步明確在晶狀體中的功能提供了有價(jià)值的研究線索。

TSR1；晶狀體；蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

先天性白內(nèi)障(congenital cataract，CC)是指出生前即存在或出生后1年內(nèi)才逐漸形成的白內(nèi)障，發(fā)病率為0.1‰~0.6‰，是一種較為常見的兒童眼病，是小兒失明和弱視的主要原因[1,2]。先天性白內(nèi)障通常表現(xiàn)為晶狀體全部或部分渾濁，常伴隨一種或多種其他的眼部并發(fā)癥，如斜視、眼球震顫、先天性小眼球、眼內(nèi)組織異常和缺失、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜病變等。先天性白內(nèi)障發(fā)病受遺傳和環(huán)境因素影響，遺傳性先天性白內(nèi)障多為單基因突變導(dǎo)致并且具有很強(qiáng)的遺傳異質(zhì)性。遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X連鎖遺傳，其中以常染色體顯性遺傳居多。目前已經(jīng)報(bào)道的先天性白內(nèi)障致病基因多達(dá)266個(gè)，其中32個(gè)基因可以導(dǎo)致單純性先天性白內(nèi)障，多數(shù)基因?qū)е戮C合征性先天性白內(nèi)障[3~6]，除白內(nèi)障表型外還包括一些眼部其他表型和身體其他組織和器官的異常和病變，如Warburg- Micro綜合征、Zellweger綜合征、Wolfram-like 綜合征和Nance-Horan綜合征等[7~10]。

本研究利用全基因組測序技術(shù)在一個(gè)中國先天性白內(nèi)障家系中篩查致病基因突變，并利用minigene、RT-PCR、免疫熒光、Western blotting和生物信息學(xué)分析探討致病可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究的家系樣本為沈陽市第四人民醫(yī)院眼科收集，3代共8名患者，遺傳方式為常染色體顯性遺傳，所有參與者均接受了裂隙燈檢查。正常人群為炎黃中國人基因頻率數(shù)據(jù)庫(Chinese millionome database, CMDB)和北京諾禾致源科技股份有限公司(NovoDb)的中國正常人群樣本庫及中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院體檢中心的105例正常人，年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織和24周人胎眼晶狀體組織的石蠟切片由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科中心提供，人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04為實(shí)驗(yàn)室自存，使用的小鼠為野生型C57BL/6，生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析來自于CBP:p300雙敲除小鼠模型。本研究通過了沈陽市第四人民醫(yī)院和中國醫(yī)科大學(xué)的倫理審查，所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 基因組DNA提取及全外顯子組測序

使用TIANamp Genomic DNA Kit(北京天根生化科技有限公司)提取先天性白內(nèi)障家系成員基因組DNA，選擇2名患者(III-3和III-5)和1名正常人(II-2)進(jìn)行全外顯子組測序。

1.3 全外顯子組測序結(jié)果分析

全外顯子組測序原始數(shù)據(jù)由BWA軟件mem命令比對到hg19參考基因組上，比對結(jié)果由samtools軟件進(jìn)行排序、標(biāo)記重復(fù)和格式轉(zhuǎn)換生成bam格式文件并構(gòu)建索引，使用GATK4.0軟件進(jìn)行snp-calling生成vcf格式儲(chǔ)存的變異信息文件，使用annovar軟件對變異進(jìn)行注釋，首先將所有變異與ExAC、dbSNP、EVS、GnomAD、1000genomes、CMDB和NovoDb等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，排除正常人群中出現(xiàn)頻率高于0.01%的變異，使用基因組可視化軟件Inte-grative Genomics Viewer (IGV)對位于外顯子、外顯子非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)和剪接位點(diǎn)的變異進(jìn)行可視化，排除假陽性結(jié)果，剩余位點(diǎn)作為候選變異。

1.4 PCR-Sanger測序及突變預(yù)測

對全外顯子組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析篩選，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增所有候選位點(diǎn)并進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證。使用MEGA-X軟件進(jìn)行位點(diǎn)保守性分析，Human splicing finder 3.1在線軟件預(yù)測突變對剪接的影響。

1.5 minigene實(shí)驗(yàn)

設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增第1內(nèi)含子3￠端150 bp序列以及第2外顯子、第2內(nèi)含子、第3外顯子、第3內(nèi)含子、第4外顯子和第4內(nèi)含子5￠端150 bp序列，上游引物TSR1-BamF：5￠-CGCGGATCCGC-TATTTGGCCGTTATTAACTCTT-3￠，下游引物TSR1- MluR：5￠-CGACGCGTAAGCCCAACACTGAACT-ACCC-3￠，以先證者基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性2 min，98℃變性20 s、60℃退火20 s、72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。經(jīng)HⅠ和Ⅰ酶切后連入pCAS2質(zhì)粒，構(gòu)建野生型和突變型minigene質(zhì)粒。pCAS2空載、TSR1野生型和TSR1突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SRA01/04細(xì) 胞，24 h后收集細(xì)胞使用Trizol(北京全式金生物 技術(shù)有限公司)提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，使用載體特異性引物(pCAS2-RTF：5￠-CTGACCCTGCTGACCCTCCT-3￠，pCAS2-RTR：5￠-TTGCTGAGAAGGCGTGGTAGAG-3￠)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物切膠回收純化，進(jìn)行Sanger測序。

1.6 小鼠組織RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用斷頸法處死實(shí)驗(yàn)小鼠，依次分離出晶狀體、大腦、肝臟、脾臟、肺、腎臟組織，PBS沖洗后剪取0.1 g組織使用Trizol提取組織總RNA。分別取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA于–20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 PCR檢測小鼠組織TSR1表達(dá)

利用PCR檢測小鼠各組織表達(dá)情況，TSR1上游引物為：5￠-CGGTGTATTTGAGTGAA-CGGG-3￠，下游引物為：5￠-CAGATCCCCTGGTCT-TGCAT-3￠，內(nèi)參GAPDH上游引物為：5￠-AGGTC-GGTGTGA-ACGGATTTG-3￠，下游引物為：5￠-GGGG-TCGTTG-ATGGCAACA-3￠。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。

1.8 人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04蛋白提取

利用RAPI裂解液提取細(xì)胞總蛋白，細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白提取按照ProteinExtTMMammalian Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit (DE201，北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行，于?80℃保存。

1.9 Western blotting檢測TSR1蛋白表達(dá)

SRA01/04細(xì)胞總蛋白、細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白12% SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TSR1一抗(1∶1000) (ab220639, abcam, UK)和β-actin一抗(1∶1000) (KGAA001-1，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，南京市)4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(KGAA35和KGAA37，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)室溫孵育，TBST洗滌后滴加顯色液在化學(xué)發(fā)光凝膠檢測系統(tǒng)中顯影檢測。

1.10 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織手術(shù)取出后立刻包埋于組織包埋劑O.T.C中，冰凍切片厚度為5 μm，切片立刻置于預(yù)冷的丙酮中固定；24周人胎眼石蠟切片置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中脫蠟處理，再依次置于體積分?jǐn)?shù)100%、95%、90%、80%和70%的梯度酒精中浸泡。PBS沖洗后將切片浸泡于抗原修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù)，封閉后滴加TSR1抗體(1∶200稀釋)和ACTB抗體(1∶100稀釋) 4℃孵育過夜。次日使用PBS沖洗后滴加兩種二抗混合液避光孵育，DAPI染液(100 mg/mL)復(fù)染，封片劑封片，使用尼康A(chǔ)1R激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.11 生物信息學(xué)分析

使用iSyTE數(shù)據(jù)庫檢索Tsr1和相關(guān)基因在不同時(shí)期的小鼠晶狀體組織中的表達(dá)變化情況，使用在線軟件DAVID進(jìn)行GO分析和KEGG分析，使用bioGRID在線軟件繪制蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)PPI圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 先天性白內(nèi)障家系基因突變分析

本研究共收集了3代18人血樣，其中患者8人，正常人10人(圖1A)。全外顯子組測序數(shù)據(jù)經(jīng)篩選后，人群頻率小于萬分之一的雜合位點(diǎn)共14個(gè)(表1)，候選位點(diǎn)在家系中進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證，結(jié)果顯示c.202-1G>A雜合突變在家系中與患者白內(nèi)障表型共分離(圖1B)。ExAC、dbSNP、EVS、GnomAD、1000genomes、CMDB和NovoDb等正常人數(shù)據(jù)庫中均未見該變異位點(diǎn)，HGMD和ClinVar等疾病數(shù)據(jù)庫也未見該位點(diǎn)的報(bào)道，家系正常人和105例正常對照不攜帶該變異位點(diǎn)。c.202-1G>A位點(diǎn)在物種間高度保守(圖1C)，Human splicing finder 3.1在線軟件預(yù)測突變會(huì)影響外顯子的正常剪接(圖1D)。

2.2 Minigene實(shí)驗(yàn)檢測突變對外顯子剪接的影響

野生型和突變型minigene質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SRA01/04細(xì)胞，24 h后提取總RNA進(jìn)行RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明pCAS2空載和野生型minigene可以正常剪接，野生型和突變型條帶大小無明顯差異(圖2A)。Sanger測序表明突變型c.202-1G>A激活了外顯子3的隱蔽剪接位點(diǎn)，導(dǎo)致突變型mRNA缺少一個(gè)堿基G，預(yù)測TSR1蛋白第68位氨基酸后發(fā)生移碼，并于其后46位形成終止密碼子，p.(Phe68Valfs*46) (圖2B)，與human splicing finder 3.1在線軟件預(yù)測結(jié)果一致。

圖1 先天性白內(nèi)障家系TSR1變異分析

A：先天性白內(nèi)障家系系譜圖。實(shí)心圓圈表示女性患者，實(shí)心方塊表示男性患者，空心圓圈表示女性正常人，空心方塊表示男性正常人，黑色箭頭表示先證者，黑色斜線表示個(gè)體已死亡。B：Sanger測序圖。WT為野生型，MT為c.202-1G>A突變型，箭頭所指為突變位點(diǎn)。C：位點(diǎn)保守性分析結(jié)果。紅色G表示突變位點(diǎn)。D：Human splicing finder預(yù)測結(jié)果。突變破壞了正常受體位點(diǎn)，形成了一個(gè)新的剪接受體位點(diǎn)。

表1 全外顯子組測序可疑位點(diǎn)Sanger測序驗(yàn)證情況

*表示終止密碼子。

2.3 RT-PCR檢測小鼠各組織Tsr1表達(dá)

以小鼠晶狀體、大腦、肝臟、脾臟、肺和腎臟組織cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示基因在所選取的6種小鼠組織中均有表達(dá)(圖3)，表達(dá)量并無明顯差異。

2.4 Western blotting檢測人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04中TSR1表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示TSR1在人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，且表達(dá)量都很高(圖4)。

2.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測人晶狀體中TSR1表達(dá)和定位

免疫熒光結(jié)果顯示TSR1在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織細(xì)胞有表達(dá)，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)(圖5A)。在24周人胎眼晶狀體纖維細(xì)胞、晶狀體上皮細(xì)胞以及晶狀體前囊組織中均有表達(dá)(圖5B)。

2.6 生物信息學(xué)分析結(jié)果

在胚胎期和出生后的小鼠晶狀體組織中持續(xù)表達(dá)(圖6A)，晶狀體特異性CBP:p300雙敲除的小鼠晶狀體中表達(dá)下調(diào)(圖6B)。使用iSyTE的Co-expression功能獲取雙敲除小鼠中與Tsr1表達(dá)模式相同的一組基因進(jìn)行GO功能、KEGG信號通路分析及PPI分析，GO分析結(jié)果顯示，與Tsr1表達(dá)模式相同的基因主要參與了代謝、生物調(diào)節(jié)、應(yīng)激等生物過程。在分子功能方面，主要參與核糖體構(gòu)成、金屬離子結(jié)合等相關(guān)功能(圖6C)。KEGG信號通路分析顯示與Tsr1表達(dá)模式相同的基因在核糖體形成、氧化磷酸化、泛素介導(dǎo)的蛋白水解和亨廷頓舞蹈病4個(gè)通路中富集(圖6D)。PPI結(jié)果顯示基因被聚類到5個(gè)不同的信號通路上，其中Rps21、Rps29、Rpl38、Rplp2、Rpl31和Imp3與Tsr1存在直接相互作用(圖6E)。

3 討論

先天性白內(nèi)障遺傳異質(zhì)性高，致病基因眾多，致病機(jī)制復(fù)雜，同一基因突變在不同家系中的表型可能不同，即使在一個(gè)家系內(nèi)，患者的表型也可能不盡相同。這也導(dǎo)致臨床診斷和遺傳學(xué)診斷困難重重。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和人類基因組數(shù)據(jù)庫的完善，已經(jīng)有越來越多的先天性白內(nèi)障致病基因和突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)[11~16]。

圖2 Minigene分析

A：RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。M：DNA Marker trans2k plusII；1：pCAS2空白載體；2：pCAS2空白載體；3：野生型pCAS2-TSR1質(zhì)粒；4：野生型pCAS2-TSR1質(zhì)粒；5：突變型pCAS2-TSR1c.202-1G>A質(zhì)粒；6：突變型pCAS2-TSR1c.202-1G>A質(zhì)粒。B：野生型和突變型RT-PCR產(chǎn)物Sanger測序結(jié)果。WT：野生型；MT：突變型。野生型可以正常轉(zhuǎn)錄，突變型產(chǎn)生缺失一個(gè)堿基“G”的轉(zhuǎn)錄本，導(dǎo)致TSR1蛋白移碼。*形成終止密碼子。

圖3 Tsr1在小鼠不同組織中的表達(dá)

A：在小鼠各組織中的表達(dá)。B:在小鼠各組織中的表達(dá)。M：DNA Marker trans2k plusⅡ；1：晶狀體；2：腦；3：肝；4：脾；5：肺；6：腎；7：空白對照。

圖4 TSR1在SRA01/04細(xì)胞中的表達(dá)

A：Western blotting檢測TSR1在SRA01/04中的表達(dá)。；B：定量分析TSR1在SRA01/04中的表達(dá)。TSR1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，沒有顯著差異。

圖5 免疫熒光法檢測人晶狀體TSR1的表達(dá)及定位

A：年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊免疫熒光結(jié)果。綠色熒光：TSR1；紅色熒光：β-actin；藍(lán)色：DAPI。B：24周人胎眼晶狀體組織免疫熒光結(jié)果。綠色熒光：TSR1；藍(lán)色：DAPI。

先天性白內(nèi)障是最早被發(fā)現(xiàn)呈常染色體顯性遺傳的人類疾病。近年來，國內(nèi)多個(gè)研究小組利用中國人群的白內(nèi)障家系資源優(yōu)勢，在致病基因定位克隆和突變基因鑒定方面取得了突出成績。2002年，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院孔祥銀團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)編碼熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族成員的基因突變可引起常染色體顯性板層白內(nèi)障和Marner白內(nèi)障[17]。2005年，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院沈巖團(tuán)隊(duì)報(bào)道基因突變導(dǎo)致皮質(zhì)性白內(nèi)障[18]。2009年，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院張學(xué)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)基因突變導(dǎo)致后極性白內(nèi)障[19]。2014年，青島眼科醫(yī)院謝立信團(tuán)隊(duì)報(bào)道基因突變導(dǎo)致白內(nèi)障小角膜綜合征[20]。2019年，中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院葉劍團(tuán)隊(duì)報(bào)道基因突變導(dǎo)致后極性白內(nèi)障[21]。

圖6 TSR1表達(dá)模式、GO功能、KEGG信號通路及PPI等生物信息學(xué)分析

A：iSyTE數(shù)據(jù)庫中表達(dá)模式。檢索iSyTE數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)Tsr1在小鼠晶狀體發(fā)育各個(gè)階段均持續(xù)表達(dá)。B：CBP: p300雙敲除小鼠晶狀體Tsr1表達(dá)。CBP: p300雙敲除小鼠晶狀體Tsr1表達(dá)下降。C：GO功能分析。提取與Tsr1表達(dá)模式相同的基因進(jìn)行GO分析。D：KEGG分析。KEGG分析結(jié)果表明基因主要被富集到核糖體形成、氧化磷酸化、泛素介導(dǎo)的蛋白水解和亨廷頓舞蹈病4個(gè)通路。E：PPI分析。提取與Tsr1表達(dá)模式相同的基因進(jìn)行蛋白–蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)下降的基因其編碼蛋白R(shí)ps21、Rps29、Rpl38、Rplp2、Rpl31和Imp3與Tsr1直接相互作用。

本研究通過全基因組測序技術(shù)，在一個(gè)中國常染色體顯性遺傳先天性白內(nèi)障家系檢測到一個(gè)可疑的候選基因變異c.202-1G>A，p.(Phe68Valfs*46)，該變異在家系中與白內(nèi)障表型共分離，正常人數(shù)據(jù)庫未見該位點(diǎn)的報(bào)道，疾病數(shù)據(jù)庫中未見該基因與人類疾病的相關(guān)報(bào)道，105名正常對照個(gè)體未攜帶此突變，因此可能是一個(gè)新先天性白內(nèi)障致病基因。

(NM_018128.4)位于17p13.3，含15個(gè)外顯子，編碼804個(gè)氨基酸。編碼前體rRNA加工蛋白，在40S核糖體成熟過程中發(fā)揮重要作用[22]?；騝.202-1G位點(diǎn)高度保守，minigene實(shí)驗(yàn)證實(shí)該變異影響了基因mRNA剪接導(dǎo)致蛋白移碼。RT-PCR、免疫熒光和Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TSR1在小鼠和人的晶狀體組織和細(xì)胞系中均有表達(dá)。通過檢索iSyTE數(shù)據(jù)庫，本研究發(fā)現(xiàn)在胚胎期和出生后的小鼠晶狀體組織中持續(xù)表達(dá)，且在CBP:p300雙敲除的白內(nèi)障小鼠晶狀體中表達(dá)下調(diào)[23]，推測其可能在晶狀體的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用并參與了敲除小鼠白內(nèi)障表型的形成。通過敲除小鼠晶狀體中與Tsr1表達(dá)模式相同基因的蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用(PPI)分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)下調(diào)的基因中參與核糖體形成的Rps21、Rps29、Rps38、Rplp2、Rpl31和Imp3均與Tsr1有直接相互作用，其中Rps21、Rps29、Rps38、Rplp2和Rpl31均為核糖體蛋白，參與核糖體的組裝和成熟[24~27]。目前已有報(bào)道核糖體蛋白L21、L15、L13a和L7a表達(dá)下調(diào)可以導(dǎo)致年齡相關(guān)性白內(nèi)障，可能原因是核糖體異常導(dǎo)致的晶狀體蛋白合成障礙[28]。由于沒有匹配的相同年齡性別的正常人晶狀體前囊膜組織做對照，本研究只檢測了TSR1在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者前囊膜組織有表達(dá)，沒有進(jìn)行定量分析其表達(dá)變化情況。在CBP:p300雙敲除小鼠晶狀體中，晶狀體蛋白α、β和γ家族基因和多個(gè)晶狀體發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)均有不同程度的下調(diào)[23]，推測這些基因的表達(dá)下調(diào)可能是由核糖體的組裝異常引起的。TSR1作為核糖體組裝的重要成分之一，可能與其他表達(dá)下調(diào)的核糖體蛋白一同參與雙敲除小鼠晶狀體表型形成。在表達(dá)下調(diào)的基因中，與Tsr1存在直接相互作用的Imp3蛋白參與MAPK-Erk信號通路，Imp3通過失活銜接蛋白Ksr1進(jìn)而抑制MAPK-Erk通路[29]。在晶狀體中，MAPK信號通路的增強(qiáng)可以誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制白內(nèi)障的發(fā)生[30]。當(dāng)Imp3基因下調(diào)時(shí)，Ksr1對MAPK通路的抑制作用增強(qiáng)，晶狀體上皮細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞過量增殖和遷移，最終可能導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生。Tsr1與Imp3的相互作用機(jī)制尚不明確，Tsr1是否能與Imp3一同調(diào)節(jié)MAPK通路，進(jìn)而影響晶狀體細(xì)胞的凋亡和增殖還需要進(jìn)一步研究確定。

綜上所述，本研究在一個(gè)中國先天性白內(nèi)障家系中通過全基因組測序及Sanger測序驗(yàn)證，檢測到變異c.202-1G>A，p.(Phe68Valfs*46)，與家系疾病表型共分離。通過minigene實(shí)驗(yàn)證實(shí)該變異影響了基因mRNA剪接。Western blotting、免疫熒光和RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TSR1在人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04、年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織、24周人胎眼晶狀體和小鼠晶狀體中表達(dá)。利用iSyTE、GO分析、KEGG分析和PPI數(shù)據(jù)庫分析，為進(jìn)一步明確TSR1在晶狀體中的功能提供了有價(jià)值的研究線索。

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Studies of congenital cataract-relatedmutation and its expression in the lens

Yajie Yu1,2, Feng Qiu3, Xin-an Zhang1

Congenital cataract (CC) is a rare disease with dysplasia of the lens, mainly characterized by partial or complete opacity of the lens. The molecular basis of the disease is complex, mutations in over 266 genes associated with congenital cataracts had been reported. In this study, a novel congenital cataract candidate genewas identified by whole genome sequencing and Sanger sequencing in a Chinese congenital cataract family. Thec.202-1G>A substitution affected splicing ofmRNA was confirmed by a minigene assay. The expression ofin mouse lens, anterior lens capsule of age-related cataract patients and 24-week human fetal lens were determined by RT-PCR, Western blotting, and immunofluorescence assays. The expression ofin the embryonic and different developmental stages of the mouse lens was confirmed by analyzing the iSyTE database. The expression ofwas down-regulated in the lens-specific CBP:p300 double knockout mouse, and a set of genes with the same expression pattern ofin the CBP:p300 double knockout mouse lens were extracted for protein-protein interaction network analysis, and six proteins were screened for direct interaction with Tsr1. GO function analysis indicated thatmight play a role in the MAPK-Erk signaling pathway in addition to its involvement in ribosome assembly. This study provided valuable research clues to further clarify the function ofin the lens.

TSR1; lens; protein-protein interaction

2019-10-14;

2020-01-01

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：81572243)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81572243)]

于雅潔，碩士研究生，專業(yè)方向：遺傳學(xué)。E-mail: 907307673@qq.com

張新安，博士，教授，研究方向：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)。E-mail: zhangxa2725@163.com

10.16288/j.yczz.19-166

2020/1/8 14:48:26

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20200107.1722.002.html

(責(zé)任編委: 徐湘民)